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1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1MLiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50%PEG3350（SigmaP3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/mlsalmonspermDNA/TE（10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachiapastoris到50mlY...
IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，la...
材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），无菌培养板，消毒1.5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台实验步骤：1.LB培养基的配制：在950ml去离子水中加入:胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min.固态培养基LB固体培养基...
一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如此，真核生物蛋白的活性往往需要翻译后加工，例如二硫键的精确形成、糖基化、磷酸化、寡聚体的形成或者由特异性蛋白酶进行的裂解等等，而这些加工原核细胞则无能为力。一些真核蛋白在原核宿主细胞中的表达不但行之有效而且成本低廉，然而许多在细菌中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下，结果使得蛋白活性低或无活性。不仅如...
转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，...
农杆菌感受态细胞的制备［实验原理］在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影...
基于片段的新药研发新技术FBDD作者：毛博新药的研发是—件耗资巨大而效率很低的工作，为了增加新药研发的效率，科学家们一直致力于寻找新的药物设计和药物筛选的方法。1990年代，Jencks提出了“基于片段的药物研发”(fragment-baseddrugdiscovery，FBDD)这一概念，即通过对于靶标结合的片段分子筛选和优化可以得到新颖的药物实体。Cell一篇综述详细解释和阐述了这一新的技术，并简单概述了B-RAF、HSP90和BACE的开发过程。什么是FBDD技术？FB...
技术|太上老君的炼丹炉：GPCRs的热稳定技术作者：毛博（需要资料图联系超博小凌）*，G-蛋白偶联受体（G-protein-coupledreceptors，GPCRs）是生物学和医学上非常重要的膜蛋白，目前已经有15种GPCRs的结构得以确定。但是，GPCRs的结构非常不稳定；GPCRs的序列非常难以测定，这就造成了研究的困难和瓶颈。如何精确快速地测定GPCRs的结构及其氨基酸序列一直是该领域研究的热点和焦点。为了解决这一难题，科学家们开发出来一种全新的技术——热稳定技术(...
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