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质粒转染大肠杆菌

发布时间:2020-03-12浏览:1747次

材料试剂:胰化蛋白胨,酵母提取物,琼脂,NaCl,NaOH(调 pH),氨苄青霉素,卡那

霉素,质粒提取试剂盒

仪器:高压灭菌锅,42℃恒温水浴锅,,恒温摇床(37℃,225rpm),无菌培养板,消毒 1.5ml

离心管,消毒枪头,无菌操作台

实验步骤:

1. LB 培养基的配制:

在 950 ml 去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇

动容器直至溶质溶解.用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容至 1L.在 15psi 高

压下蒸汽灭菌 20min.

固态培养基

LB 固体培养基及倒板 :

(1).配制:100mlLB 培养基加入 1.5g 琼脂粉

(2).抗生素的加入:高压灭菌后,将融化的 LB 固体培养基置与 55℃的水浴中,待培

养基温度降到 55℃时(手可触摸)加入氨苄抗生素(终浓度为 50μg/ml),以免温度过

高导致抗生素失效,并充分摇匀。

(3)

.倒板:一般 10ml 倒 1 个板子。培养基倒入培养皿后,打开盖子,在紫外下照 10-15

分钟。

(4).保存:用封口胶封边,并倒置放于 4℃保存,一个月内使用。

2. 从-70℃冰箱中取 200μl 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

3. 加入质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng,体积不超过 10μl),轻轻摇匀,冰上放置 30

分钟后。4. 42℃水浴中热击 45s/90s,热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。

5. 向管中加入 1ml LB 液体培养基(不含 Amp),混匀后 37℃振荡培养 1 小时,使细菌恢

复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。

6. 将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌

液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养 16-24 小时。

同时做两个对照:

对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,其它操作与上面相同。此组正常情

况下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。

对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,但涂板时只取 5μl 菌液涂布于不

含抗生素的 LB 平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。

大肠杆菌的扩增

1. 从 LB 平板上挑取新活化的单个菌落,接种于 3-5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡

培养 12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种

于 100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养 2-3 小时至 OD600 =0.5 左右。

2. 取上述培养液置于冰中 10min,之后转移到已灭菌的 50ml 离心管中再于冰上放置

5min

3. 于 4℃离心,2700rmp,10min,弃上清,收集细菌

4. 质粒的提取

准备大肠杆菌质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液

5. 质粒鉴定(琼脂糖凝胶电泳)

质粒转染细胞株

材料 细胞株、质粒、培养基、链霉素/青霉素(双抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷

酸盐缓冲溶液)、胰酶/EDTA 消化液、转染试剂(Lipofectamine TM2000

实验步骤

Ⅰ.准备细胞:

贴壁细胞:转染前 24 h,在 500 µL 无双抗完全培养基中接种 0.5-2×105 个细胞,

转染时细胞融合度为 80 - 90% 。 ( 注:铺板时要将细胞消化完全混匀,避免细胞

堆积生长。)

II .对于每个转染样品,按下面的方法准备:

(1)用 50 µL Opti-MEM 稀释 0.8 µg 质粒 DNA,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下

静置 5 min。

(2)轻轻颠倒混匀转染试剂,用 50 µL Opti-MEM 稀释 2.0 µL Lipofectamine

TM2000,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下静置 5 min。

(3)混合转染试剂和质粒 DNA 稀释液,轻轻吹吸 3 - 5 次混匀,室温下静置 20

min。注: 转染复合物一旦形成,应立即加入培养皿中进行细胞转染。

(4)转染复合物加入到 24 孔细胞板中,100 µL/孔,前后轻摇细胞板混合均匀。

(5)将细胞板置于 37℃、5% CO2 培养箱中培养 6 h 左右,进行换液,换成含 10%

血清的普通培养基,在 37℃,5%CO2 孵育箱中继续培养 24h 左右。

稳定转染细胞株的筛选(各种细胞用什么抗生素筛选呢)

从 37℃,5%CO2 孵育箱中取出培养皿,弃去含转染试剂的培养基,用 PBS 冲洗细胞

2 遍,胰蛋白酶消化,接种 1/2 的细胞到 100 mm 培养皿中,加入含 500 µg/ml G418 的

新鲜培养基,每 2-3 天更换一次新的筛选培养基,每天观察细胞的死亡情况。当正常细胞完全死亡后,换用新的不含 G418 的培养基培养。每天观察细胞生长状态。在细胞达到 60%

汇合率时再用含 500 µg/ml G418 的培养基筛选一次。当细胞达到 90%以上汇合率时将细

胞转移至培养瓶中继续培养(转染后 10-12 天左右)。以后每隔 4-5 天再用含 500 µg/ml

G418 的培养基筛选。直到稳定表达转染质粒的细胞达到一定数量后可以收集样品(约转染

后 15 天左右)。以后继续培养时加入的 G418 浓度降一半。

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