当前位置:首页 > 技术文章 > 毕氏酵母(Pichia pastoris)感受态细胞制备及转化

毕氏酵母(Pichia pastoris)感受态细胞制备及转化

发布时间:2020-03-13浏览:617次

1、毕氏酵母氯化锂转化法

(1)试剂

1M LiCl(用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释)

50% PEG3350(Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶

子分装)

2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存

注:醋酸锂对毕氏酵母无效,仅氯化锂有效;PEG3350 可屏蔽高浓度 LiCl 的毒害作用;

(2)感受态毕氏酵母的制备

接种 Pachia pastoris 到 50ml YPD 培养基中,30℃摇菌过夜(约 24~28h)培养到 OD

值为 0.8~1.0(约 108 Cells/ml);

收获细胞,用 25ml 无菌水洗涤一次,室温下 1500g 离心 10min;

重悬细胞于 1ml 100mM LiCl 溶液中,将悬液转入 1.5ml 离心管;

离心机最大速度离心 15 秒沉淀菌体,重悬菌体于 400ul 100mM LiCl 溶液中;

按 50ul/管分装,立即进行转化;

注:不要将感受态酵母菌冰浴;

(3)毕氏酵母的转化

煮沸 1ml 鲑鱼精 DNA 5min,迅速冰浴以制备单链担体 DNA;

将感受态酵母菌离心,以 Tips 去除残余的 LiCl 溶液;

对于每一个转化,按以下顺序加入:

50% PEG3350 240ul

1M LiCl 36ul2mg/ml 单链 Salmon sperm DNA 25ul

5~10ug/50ul H2O 质粒 DNA 50ul

剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀(约 1min);

30℃水浴孵育 30min;

42℃水浴热休克 20~25min;

6000~8000rpm 离心收集酵母菌体;

重悬酵母于 1ml YPD 培养基,30℃摇床孵育;

1~4h 后,取 25~100ul 菌液铺选择性培养基平板,于 30℃培养 2~3 天鉴定;

2、毕氏酵母 PEG1000 转化法

(1)试剂

缓冲液 A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol

缓冲液 B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35

缓冲液 C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35

未污染的新鲜、试剂级 DMSO,-70℃保存

注:

缓冲液 A、B、C 均用滤膜过滤,-20℃保存;

将 DNA 直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,

其摄取外源 DNA 的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按 6 样品/

组进行);

(2)待转化毕氏酵母的制备

接种环接种 Pachia pastoris 于 YPD 平板,30℃培养 2d;

挑取单克隆酵母菌株于 10mlYPD 培养基中,30℃振荡培养过夜;取步骤 2 中小量菌液接种到 100mlYPD 培养基中振荡培养,待其 OD 值从 0.1 升到 0.5~

0.8;

室温下 3000g 离心收集酵母菌体,50ml 缓冲液 A 洗涤一次;

重悬菌体于 4ml 缓冲液 A 中,按 0.2ml/管分装于 1.5ml 的离心管中,每管加入 11ulDMSO,

混合后迅速于液氮中冷冻,

-70℃保存

(3)毕氏酵母的转化

将约 50ug 线性化质粒 DNA 溶于 20ul TE 或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体

DNA(40ug 变性超声线性化鲑鱼精 DNA)以获得最大转化率;

37℃水浴孵育 5min,中间混合样品 1~2 次;

取出离心管,加入 1.5ml 缓冲液 B,彻底混匀;

30℃水浴孵育 1h;

室温下 2000g 离心 10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于 1.5ml 缓冲液 C 中;

离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于 0.2ml 缓冲液 C 中;

将所有转化液铺于选择性平板,于 30℃孵育 3~4 天后,鉴定;

3、毕氏酵母电转化法

(1)E.coli TOP10F’感受态细胞的制备

取 10ul TOP10F’菌液,接种于 200ml LB 液体培养基中活化培养,37℃,200 rpm,16~

18 小时。取 100ul 菌液接种于 200ml 液体 LB 培养基中。

37℃,200 rpm,培养 16~18 小时。

灭菌 500 ml 离心管,4℃,4000 rpm,20 min。得菌体沉淀。弃上清,菌体用 10%甘油

重悬并洗涤。重复洗涤 3 次。第三次离心后,弃绝大部分上清,留下约 1ml 液体用于重悬菌体。

从制得得感受态细胞中,取 200ul 于灭菌 EP 管中,加入连接反应产物 5ul,混匀,不要产

生气泡,在冰上放置 5min。

将混匀后得 200ul 菌液移入电击杯中。

使用电击穿孔仪进行转化,设置为电压 2500 V,时间 5 ms。

电击后,往电击杯中加入 800ul SOC 培养基,冲洗出菌体,转移至灭菌 1.5 ml EP 管中。

37℃,150 rpm ,轻摇 45~60 min。

取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的 LLB-Zeocin 平板上,正放,待涂布液不在流

动,37℃ 培养 12~16 小时。

(2)线性化质粒 DNA 对 Pichia pastorisGS115 的转化

取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中,使其完全解冻;

1)将 100μl 菌体移出至一新的无菌 Eppendorf 管中,加入 5-20μg 线性化质粒(5~10μl),

轻弹混匀,尽数吸出转移到 0.2cm 型的电穿孔转化杯中;

2) 转化杯置于冰浴中 5~10 分钟,保持低温。

3) 电穿孔转化电击条件:电压:1500V;电阻:400Ω;电容:25μF;脉冲时间:10mS;

一次电击。

4) 电击后,马上在电击转化杯中加入 1ml 4℃预冷的 1M 的山梨醇溶液,用微量移液枪吹

打均匀,置于冰浴中;

5) 取 30℃烘至表面半干的 MD 培养基平板,在超净工作台上无菌操作涂布平板,400μl/

3.4 毕赤酵母电转化方法

3.4.1 菌体的准备:1. 挑取酵母单菌落,接种至含有 5ml YPD 培养基的 50ml 三角瓶中,30℃、250-300r/min

培养过夜;

2. 取 100-500μl 的培养物接种至含有 500ml 新鲜培养基的 2L 三角摇瓶中,28~30℃、

250-300r/min 培养过夜,至 OD600 达到 1.3~1.5;

3. 将细胞培养物于 4℃,1500g 离心 5min,用 500ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;

4. 按步骤 3 离心,用 250ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;

5. 按步骤 3 离心,用 20ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬;

6. 按步骤 3 离心,用 1ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为

1.5ml;

7. 备注:可将其分装为 80μl 一份的包装冷冻起来,但会影响其转化效率(2 周之内)。

3.4.2 电击转化:

8. 将 5~20μg 的线性化 DNA 溶解在 5~10μl TE 溶液中,与 80μl 的上述步骤 6 所得的菌

体混匀,转至 0.2cm 冰预冷的电转化杯中;

9. 将电转化杯冰浴 5min;

10. 根据电转化仪提供的资料,参考其他文献及多次摸索,确定合适的电压、电流、电容等

参数,按优化的参数,进行电击;

11. 电击完毕后,加入 1ml 冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至 1.5ml 的 EP 管中;

12. 将菌体悬液涂布于 MD 或 RDB 平板上,每 200~600μl 涂布一块平板;

13. 将平板置于 30℃培养,直至单个菌落出现。

推荐:电压 1.5kV;电容 25μF;电阻 200Ω。电击时间为 4~10msec

Contact Us
  • 联系QQ:277124344
  • 联系邮箱:277124344@qq.com
  • 联系电话:13760660301
  • 联系地址:广州市天河区明旭街5号

扫一扫  微信咨询

© 2020 广州市超博科技有限公司 版权所有  备案号:粤ICP备19162636号

技术支持:化工仪器网    管理登陆    GoogleSitemap

服务热线
13760660301

微信服务号