1、毕氏酵母氯化锂转化法

（1）试剂

1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）

50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶

子分装）

2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存

注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350 可屏蔽高浓度 LiCl 的毒害作用；

（2）感受态毕氏酵母的制备

接种 Pachia pastoris 到 50ml YPD 培养基中，30℃摇菌过夜（约 24～28h）培养到 OD

值为 0.8～1.0（约 108 Cells/ml）；

收获细胞，用 25ml 无菌水洗涤一次，室温下 1500g 离心 10min；

重悬细胞于 1ml 100mM LiCl 溶液中，将悬液转入 1.5ml 离心管；

离心机大速度离心 15 秒沉淀菌体，重悬菌体于 400ul 100mM LiCl 溶液中；

按 50ul/管分装，立即进行转化；

注：不要将感受态酵母菌冰浴；

（3）毕氏酵母的转化

煮沸 1ml 鲑鱼精 DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体 DNA；

将感受态酵母菌离心，以 Tips 去除残余的 LiCl 溶液；

对于每一个转化，按以下顺序加入：

50% PEG3350 240ul

1M LiCl 36ul2mg/ml 单链 Salmon sperm DNA 25ul

5～10ug/50ul H2O 质粒 DNA 50ul

剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体*分布均匀（约 1min）；

30℃水浴孵育 30min；

42℃水浴热休克 20～25min;

6000～8000rpm 离心收集酵母菌体；

重悬酵母于 1ml YPD 培养基，30℃摇床孵育；

1～4h 后，取 25～100ul 菌液铺选择性培养基平板，于 30℃培养 2～3 天鉴定；

2、毕氏酵母 PEG1000 转化法

（1）试剂

缓冲液 A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol

缓冲液 B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35

缓冲液 C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35

未污染的新鲜、试剂级 DMSO，-70℃保存

注：

缓冲液 A、B、C 均用滤膜过滤，-20℃保存;

将 DNA 直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，

其摄取外源 DNA 的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按 6 样品/

组进行）;

（2）待转化毕氏酵母的制备

接种环接种 Pachia pastoris 于 YPD 平板，30℃培养 2d;

挑取单克隆酵母菌株于 10mlYPD 培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤 2 中小量菌液接种到 100mlYPD 培养基中振荡培养，待其 OD 值从 0.1 升到 0.5～

0.8；

室温下 3000g 离心收集酵母菌体，50ml 缓冲液 A 洗涤一次；

重悬菌体于 4ml 缓冲液 A 中，按 0.2ml/管分装于 1.5ml 的离心管中，每管加入 11ulDMSO，

混合后迅速于液氮中冷冻，

-70℃保存

（3）毕氏酵母的转化

将约 50ug 线性化质粒 DNA 溶于 20ul TE 或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体

DNA（40ug 变性超声线性化鲑鱼精 DNA）以获得大转化率；

37℃水浴孵育 5min，中间混合样品 1～2 次；

取出离心管，加入 1.5ml 缓冲液 B，*混匀；

30℃水浴孵育 1h；

室温下 2000g 离心 10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于 1.5ml 缓冲液 C 中；

离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于 0.2ml 缓冲液 C 中；

将所有转化液铺于选择性平板，于 30℃孵育 3～4 天后，鉴定；

3、毕氏酵母电转化法

（1）E.coli *0F’感受态细胞的制备

取 10ul *0F’菌液，接种于 200ml LB 液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～

18 小时。取 100ul 菌液接种于 200ml 液体 LB 培养基中。

37℃，200 rpm，培养 16～18 小时。

灭菌 500 ml 离心管，4℃，4000 rpm，20 min。得菌体沉淀。弃上清，菌体用 10％甘油

重悬并洗涤。重复洗涤 3 次。第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约 1ml 液体用于重悬菌体。

从制得得感受态细胞中，取 200ul 于灭菌 EP 管中，加入连接反应产物 5ul，混匀，不要产

生气泡，在冰上放置 5min。

将混匀后得 200ul 菌液移入电击杯中。

使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压 2500 V，时间 5 ms。

电击后，往电击杯中加入 800ul SOC 培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌 1.5 ml EP 管中。

37℃，150 rpm ，轻摇 45～60 min。

取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的 LLB－Zeocin 平板上，正放，待涂布液不在流

动，37℃ 培养 12～16 小时。

（2）线性化质粒 DNA 对 Pichia pastorisGS115 的转化

取新鲜制备的（或－70℃冻存的）感受态细胞置于冰浴中，使其*解冻；

1）将 100μl 菌体移出至一新的无菌 Eppendorf 管中，加入 5－20μg 线性化质粒（5～10μl），

轻弹混匀，尽数吸出转移到 0.2cm 型的电穿孔转化杯中；

2) 转化杯置于冰浴中 5～10 分钟，保持低温。

3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V；电阻：400Ω；电容：25μF；脉冲时间：10mS；

一次电击。

4) 电击后，马上在电击转化杯中加入 1ml 4℃预冷的 1M 的山梨醇溶液，用微量移液枪吹

打均匀，置于冰浴中；

5) 取 30℃烘至表面半干的 MD 培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/

板

3.4 毕赤酵母电转化方法

3.4.1 菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有 5ml YPD 培养基的 50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min

培养过夜；

2. 取 100-500μl 的培养物接种至含有 500ml 新鲜培养基的 2L 三角摇瓶中，28~30℃、

250-300r/min 培养过夜，至 OD600 达到 1.3~1.5；

3. 将细胞培养物于 4℃，1500g 离心 5min，用 500ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

4. 按步骤 3 离心，用 250ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

5. 按步骤 3 离心，用 20ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

6. 按步骤 3 离心，用 1ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为

1.5ml；

7. 备注：可将其分装为 80μl 一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2 周之内）。

3.4.2 电击转化：

8. 将 5~20μg 的线性化 DNA 溶解在 5~10μl TE 溶液中，与 80μl 的上述步骤 6 所得的菌

体混匀，转至 0.2cm 冰预冷的电转化杯中；

9. 将电转化杯冰浴 5min；

10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等

参数，按优化的参数，进行电击；

11. 电击完毕后，加入 1ml 冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至 1.5ml 的 EP 管中；

12. 将菌体悬液涂布于 MD 或 RDB 平板上，每 200~600μl 涂布一块平板；

13. 将平板置于 30℃培养，直至单个菌落出现。

推荐：电压 1.5kV；电容 25μF；电阻 200Ω。电击时间为 4～10msec