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IPTG 诱导蛋白表达的原理及方法步骤

发布时间:2020-03-12浏览:194次

IPTG 诱导蛋白表达的原理及方法步骤

E.coli 的乳糖操纵子(元)含 Z、Y 及 A 三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰

基转移酶,此外还有一个操纵序列 O、一个启动序列 P 及一个调节基因 I。I 基因编码一种

阻遏蛋白,后者与 O 序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列 P 上

游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由 P 序列、O 序列和 CAP 结

合位点共同构成 lac 操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产

物的协调表达 。在没有乳糖存在时,lac 操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I 序列在 PI

启动序列操纵下表达的 Lac 阻遏蛋白与 O 序列结合,阻碍 RNA 聚合酶与 P 序列结合,抑

制转录起动。当有乳糖存在时,lac 操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,

真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经 b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者

作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与 O 序列解离、发生

转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,

因此被实验室广泛应用。

材料

1、诱导表达材料

( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基

酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g

NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2%

蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

适用范围:大肠杆菌

( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG 溶于 10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成 1

mL /份,-20 ℃ 保存。( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液:

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS (电泳级)

0.1 % 溴酚蓝

10 % 甘油

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料

1 )酶溶法

(1)裂解缓冲液:

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

(2)50 mmol / L 苯甲ji huang酰氟(PMSF )。

(3)10 mg / mL 溶菌酶。

(4)脱氧胆酸。

(5)1 mg / mL DNase I。

2 )超声破碎法

( 1 ) TE 缓冲液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液:

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS0.2 % 溴酚蓝

20 % 甘油

实验方案

1、外源基因的诱导表达

( 1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体 DNA 和目的基因。

( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。

( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒 DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列

测定,

确定无误后进行下一步。

( 4 )如果表达载体的原核启动子为 PL 启动子,则在 30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的

OD600 达 0.4-0.6 ,迅速使温度升至 42 ℃ 继续培养 3 -5h ;如果表达载体的原核启动

子为 tac 等,则 37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加 IPTG 至终浓度为 1 mmol / L。

继续培养 3 -5h 。

( 5 )取上述培养液 1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加 100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳

上样缓冲液后,作 SDS -PAGE 检测。

2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化

1 )细菌的裂解

常用方法有:① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等。

前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验

室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。

(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多

糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为:① 4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL )。弃上清,

约每克湿菌加 3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀。

 

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