当前位置:首页 > 技术文章 > co-IP实验

co-IP实验

发布时间:2020-12-10浏览:138次

由于co-IP相对问题较多,以co-IP为例进行介绍。

 Step 1固定抗体

 

Step 2加样

 

Step 3结合,去除非特异性蛋白

 

Step 4靶蛋白(红色)洗脱或者互作蛋白复合物(红色+黄色)洗脱

 

 

Step 5分析检测—Western Blot或者质谱

常用“黑话”

 

 上图证明了EDR1和EDR4有相互作用。如果想要设计好实验,让我们先弄清以下“黑话”的意思吧。

阳性对照:证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白(IP)或者互作蛋白对(co-IP,比如诱饵蛋白X和靶蛋白Y),即为常说的input。可直接取抽好的蛋白溶液进行Western。

阴性对照:用来排除假阳性。IP/co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白对都检测到了,固然是值得高兴的,但是这结果是不是假阳性呢?还得做个阴性对照。阴性对照如何设置呢?考虑到整个实验体系会出现beads、抗X抗体、诱饵蛋白X、靶蛋白Y(co-IP):

 

 *注意:总蛋白上样量过多也会造成 非特异性结合,建议上样量为500ug-1mg。上样之前一定要先用BCA定个量!定个量!定个量!

 

pre-clear:上样前先用裂解液过一遍柱子,减少基质本身对蛋白的吸附。

 

Output:在某些co-IP实验中,实验人员会把IP后的上清分别进行诱饵蛋白X和靶蛋白Y的WB检测,该对照组称为output组。

 

内源性co-IP实验,如果终结果为阳性,则可以证明两个蛋白之间存在相互作用;但是结果为阴性,是否两个蛋白就一定不发生相互作用了了呢?也不一定。有可能是两个蛋白是弱相互作用力,这时候可能需要交联剂协助,锁定强化弱互作蛋白;也有可能是内源蛋白表达量低,可先做过表达co-IP作为对照。

 

 * 超博提供现货订购,详情咨询。资料仅供参考,谢谢观看(* ̄︶ ̄)!

Contact Us
  • 联系QQ:277124344
  • 联系邮箱:277124344@qq.com
  • 联系电话:13760660301
  • 联系地址:广州市白云区鹤正街1号中海联8立方创意园A1栋307室

扫一扫  微信咨询

© 2021 广州市超博科技有限公司 版权所有  备案号:粤ICP备19162636号

技术支持:化工仪器网    管理登陆    GoogleSitemap

服务热线
13710660294

微信服务号