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如何高效又稳定的构建干细胞疾病模型?

发布时间:2020-12-14浏览:101次

为什么多能干细胞大有前途?

      人类多能干细胞具有自我更新能力并且具有分化成为任何细胞类型的潜力,帮助克服现有动物模型中对某些疾病的限制。虽然动物模型长久以来被用于研究疾病的不同发育阶段,但该类模型并不完美,比如,动物模型心脏的尺寸以及静息心率与人类有很大的差异,在一些情况下某些疾病的表型可能是无法准确呈现。

 

        此外,病人来源的人类细胞的培养虽也逐渐被用于科学研究以及医疗发展。但是从病人血液或者组织中分离得到的这些细胞系很难持续的培养,同时特定的细胞系也很难从中分离得到。

 

        人类多能干细胞(Pluripotent stem cells,PSCs)恰恰改变了以上困境。PSCs来源于正常的原代细胞,具有无限自我更新的能力,可通过诱导获得特定的细胞类型。诱导多能干细胞(iPSCs)越来越多地被用于人类疾病模型的研究,为疾病模型的建立及其在药物筛选中的应用创造了新的可能性。此外,结合CRIPSR-Cas9等基因编辑技术,还能够在iPSCs疾病模型中引入或纠正疾病相关的突变,从而研究突变对疾病表型的影响。

 

     基于iPSC构建疾病模型的流程基于iPSC构建疾病模型的步骤包括体细胞重编程为hiPSC、通过基因组编辑产生基因对(包括对照和突变的hiPSCs)、hiPSCs细胞系的克隆和鉴定、hiPSCs细胞系的分化以及疾病模型的可视化。

 

        基于iPSC构建相关疾病模型及研究进展帕金森症是一种在中老年中常见的神经退行性疾病,主要生理学症状是多巴胺能神经元的丢失、α-突触核蛋白的聚集、路易氏体的出现。现有的帕金森症治疗仅针对疾病的症状,不能治愈或延缓病情发展。为寻找到更有效、确的靶点,一个全面且准确的帕金森症模型变得异常重要。一般而言,遗传小鼠模型不能代表患者中观察到的病理生理神经退行性变和蛋白聚集模式。另一方面,局部或系统给予神经毒素的帕金森症动物模型虽成功地复制了多巴胺能神经元的神经退行性变化,但它们不能以缓慢、渐进的方式再现退行性病变,也不能形成在病人病理中出现的路易氏体。

 

       利用细胞重编程和基因编辑技术,可从患者体细胞中产生疾病特异性的iPSC,有助于了解功能相关性的分子发现和个人遗传变异等。2020年The New England journal of Medicine杂志上发表文章题为《Personalized iPSC-Derived Dopamine Progenitor Cells for Parkinson's Disease》,报道了从自体诱导多能干细胞分化的中脑多巴胺能祖细胞植入特发性帕金森病患者体内产生的缓解帕金森症的研究。

 

         患者特异性祖细胞是在良好的制造条件下产生的,并具有黑质致密部神经元的表型特性;在人源化小鼠模型的实验中表明,这些特异性的祖细胞缺乏免疫原性,当被植入帕金森症病患者的壳核,不需要进行免疫抑制。帕金森症的临床症状在诱导的特异性祖细胞植入后18到24个月稳定或改善。因此,利用iPSC在临床方面缓解帕金森症已经初见曙光。

 

    诱导多能干细胞的技术除了用于建立帕金森症的模型之外,还在多种疾病的模型建立以及科学研究过程中发挥着关键作用。比如诱导多能干细胞来源的心肌细胞模型可用于研究心肌细胞的功能和功能障碍、药物筛选和毒性、以及心脏病新药的开发。

 

除此之外,诱导多能干细胞还广泛用于建立表征不同3D结构的组织和类器官(Organoid)。比如2013年Nature发表论文题为《Cerebral organoids model human brain development and microcephaly》,开发出了人类诱导多能干细胞的衍生的3D器官培养系统,利用该类器官模型,研究人员使用RNA干扰和患者特异性诱导的多能干细胞来模拟小头症(Microcephaly)患者,是一种很难在小鼠身上进行重现的疾病,并证明了患者器官样体中神经元的过早分化缺陷可以帮助解释疾病的表型。总的来说,诱导多能干细胞在复杂的人体组织中衍生的三维类器官也能再现发育过程和疾病特征。

     但诱导多能干细胞建立相关疾病模型也并非完美方案。如何将患者来源的细胞准确分化为目标细胞、如何建立背景类似的对照组、防止本身遗传背景对于一些关键表型的掩盖作用,以及重编程的效率和表观遗传的特征,都是研究者未来需要考虑的。没有一项技术是完美的,但诱导多能干细胞模型的建立大大扩展了我们精细模拟疾病发生发展的过程以及对药物筛选和鉴定使用范围,为未来开发相应疾病的治疗方案和临床药物提供了重要工具。

细胞重编程:

     该系统基于复制缺陷型仙台病毒(SeV)的载体,安全且高效地导入并表达一些关键的遗传基因,它们是将体细胞重编程为iPSC所必需的。多种细胞经验证,如成纤维细胞、PBMCs、CD34+细胞、T细胞、微血管内皮细胞、尿细胞、羊水细胞、骨骼肌成肌细胞等。此外,CTS™ CytoTune-iPS 2.1 仙台病毒重编程试剂盒—无缝转移至临床培养。

细胞改造: 

       使用Neon转染系统进行电穿孔或使用Invitrogen Lipofectamine 干细胞转染试剂进行脂质转染,将编辑工具递送到iPSC中。虽然这两种方法都能成功完成基因组编辑,但电穿孔递送基因编辑工具通常编辑效率更高。

 细胞培养:

 单细胞分选hiPSC需要稳定的培养基,既可培养单个hiPSC且适用于hiPSC扩增培养,同时无需每天换液。

 细胞鉴定:

       畸胎瘤形成是证明hiPSC细胞系多能性的方法之一,但这一过程过于漫长且需要动物实验。在基因表达分析中使用从hiPSC和拟胚体(一种从hiPSC产生所有三个胚层的无偏差方法)分离的mRNA,可通过检测hiPSC中是否存在多能性基因及拟胚体中是否存在胚层基因,验证多能性。除此之外,您也选择使用PluriTest检测和KaryoStat检测。

 

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