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免疫组化之 8 大疑难解答及 10 大实战经验

发布时间:2020-03-24浏览:236次

作者:子非鱼

免疫组化(IHC),此种高端大气上档次的实验自然深得科研者的宠爱。然而做过该实验的人

都知道,IHC 看似容易,但其花样百出的问题总是让实验汪们的精神备受摧残,苦不堪言。

本文就对免疫组化进行抽丝剥茧的剖析,还其一片净土。

675IHC 反应实验流程

IHC 常见的 大疑问

Q1:冰冻切片和石蜡切片如何取材?

Answer: 冰冻切片取材可分为两种情况:

676677

1)动物灌流固定:如小鼠心脏灌流,首先采用预冷的 1×PBS 灌流冲洗直至血液全部放出,

随后灌注 4%PFA 直至小鼠僵直,而后解剖获取组织,于 44%PFA 中固定 1h 左右,1×PBS

洗 次(30min/次),25%蔗糖溶液脱水 12h 左右包埋即可。

2)直接取材:直接选择新鲜组织进行冰冻切片,此时不需要进行抗原修复。缺点:切出的

片子含水量会比较多,形成冰晶影响结果,而且后期的丙酮固定也会改变细胞的形态。

石蜡切片:动物组织取材(灌流与否都可以,并不影响后续的操作)后,置于 10%福尔马林

溶液中固定 3-4 天后,脱水,包埋,即可进行石蜡切片操作。

Q2:石蜡切片和冰冻切片的区别比较

Answer: 1)石蜡切片制备过程较复杂,抗原活性差,但切片薄(3-5μm),便于观察细胞的细

微结构,且常温保存即可,非常方便。2)冰冻切片较厚(8-12μm),操作简单,抗原活性好,

但是保存时间短,且一定放在-80的低温冰箱中。

Q3:一抗的选择要点是什么?

Answer1)一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对低;而多克

隆抗体特异性弱,但抗体的亲和力强,灵敏度高,但易出现非特异性染色(可通过封闭来避

免)。2)抗体的比例可依据抗体说明书或 western blot 的抗体比例来做即可。3)对于组织样 

本,一般要在 37孵育 1-2h 或 4冰箱孵育过夜(效果zui佳,且拿出后需 37复温 45min),

并保持湿盒里的湿度来防止抗体蒸发。对于难以着色的,在第二天还需将湿盒置于室温孵育。Q4:如何选择封闭血清?

Answer:封闭血清一般是和二抗同一来源,可封闭非特异性结合位点,降低背景噪音。也可

使用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗的来源一致。

Q5DAB 显色时间如何把握?

Answer:可选择一张阳性的片子,用计时器精确计时在显微镜下判断出具体时间后,再对所

有片子进行显色,采用相同的时间来界定。一般如果抗体浓度适宜,操作无误,10 分钟内肯

定能够显色,如果超过该时间,说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。显色时间越短,

则说明抗体浓度高或抗体孵育时间过长,需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。

Q6IHC 复染时间的选择?

Answer:苏木素复染时间一般为 5min 左右,可调整,染色时间太浅,可延长时间,反之缩

短时间;随后进行盐酸酒精分化,数秒即可,自来水洗,zui后置于氨水中返蓝。

Q7:免疫组化的结果如何分析?

Answer1)必设对照组。如阴性、阳性及自身对照。

678由表中可知,只有 6实验结果有意义。1-5 均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因

ICH 技术操作存在错误等而使实验结果失去意义,则必须重复实验或换用抗体。

2)阳性着色细胞计数法。在 40 倍光镜下,随机选择不重叠的 10 个视野,人工或机器计

数阳性着色细胞,每组 3-6 张不同动物组织切片,然后进行组间比较即可。

3)灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用

image j 进行灰密度分析,然后进行统计分析即可。

4)分级法。免疫组化的半定量一般分为三级:弱(+),中(++),强(+++)。以绿色免疫荧

光为例,则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱(+=1,中(++=2

强(+++=3。至少随机观察 5-10 个 HPF。然后根据(+% x 1 +++% x 2 ++++% x 3

计算出数值;总数值<1.0 者为(+),1.0-1.5 者为(++), >1.5 者为(+++)

679Q8IHC 常见的疑难杂症有哪些?

Answer

680免疫组化(IHC)的十大实战经验

1.把要做的切片先分好,做几个抗体可分几盒,不正常组织与正常组织要分开。其余做预实

验用。

2.选择实验要做的抗体时,要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。

6813.试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。如:肝组织生物素含量高,S-P 试剂盒生物素含

量也高,故不能配合使用。

4.每次开始做时,都必须先清点实验的必需品是否齐全。想好可能发生的意外,并先想好补

救措施。当抗体不够用的情况下,原先买的抗体zui好不要用完,留做可能需要的验证试验。

新的抗体要尽量同公司,同批号。

5.烤片(单一或综合)程度要适情况而定,可中途拿出甩一甩,尽可能先放在烤箱里烤 

时以上。切勿把片烤得太久了。程度刚好,脱蜡效果才会好。注意做好不同条件的切片标记。 

注意温度稳定,再烤片。

6.二甲苯脱蜡。温度过低时,可先把二甲苯整罐放进烤箱加热,或者可把片放在二甲苯里一

起加热脱蜡,这样效果会更好;若温度适宜,那还是在室温下脱蜡,要不可能会适得其反。

时间也是适情况而定。

7.高压修复时,要注意稀释比例,修复液的种类(EDTA 不可以重新进行利用,可能发生交叉

作用),PH 值等。高压锅内压力未降至正常时不可打开,压力正常后可多放会儿,能更好的

利用余压,把握程度。若是多次修复,每次都需先把锅内热水倒掉,换冷水,保证条件的可

重复性。

8.抗体反复冻融可使效价降低。抗体要防止污染。不可用塑料保存,塑料可吸附抗体。抗体

稀释:应遵循现用现配的原则,对于 PBS(其他稀释液,注意 PH 值,PBS 为偏中碱性)稀

释的抗体zui好要当天使用。稀释比例恰好为佳,注意前带和后带效应。

6829.吹干封片时不能有泡泡。若是没封好,可进行二甲苯、酒精脱树胶,吹干再次封片,但镜 

下效果会明显变差。因而,若没必要,zui好不要再次脱胶。DAB 显色需用中性树胶封片,AEC

(易溶于有机溶剂)需用水性胶封片。

10.刚封完的载玻片会移动,故切片还没干时,尽量不要碰到盖玻片,可避免树胶溢出,片的

整体效果不好。

附录:临床上常用免疫组化指标

通常恶性肿瘤,免疫组化耐药预后标记(共 个 marker)为:P-gpGSTπTOPOIIKi-67

而乳腺癌免疫组化耐药预后标记(共 个 marker)为:P-gpGSTπTOPOKi-67ER

PRC-erbB-2

6836846856866875.2 ELISA

一句话知晓实验方法怎么选?WBSPR

688ELISA

作者:麦子

在分子生物学实验室里的玩法,无非就是用某种特定的刺激物(如细胞活素)去刺激一些细

胞或组织,让它们 high 起来,然后分析细胞对这些外源刺激物的反应,检测细胞内哪条信

号通路被激活或失活,或者什么蛋白被分泌出来。这里面就有很多种方法,哪种zui合适,关

键看你要检测这个反应的哪个方面的特性。

WB

建立蛋白质的个人档案

一个典型的免疫印迹实验(Western BlotWB)可检测信号通路中某种蛋白质的特性、表达

和分布,分析容量大、敏感度高、特异性强。

但 至 于 蛋 白 蛋 白 相 互 作 用 则 要 用 另 一 种 更 复 杂 的 方 法 , 即 免 疫 共 沉 淀 法 ( Co

immunoprecipitationCo-IP),它接近细胞内的生理情况,是以成为经典方法。

689WB 影视,实验做累了可以用

SPR

想知道 Ta 和 Ta 能有多亲密?

表面等离子共振(Surface Plasmon ResonanceSPR)除了研究蛋白-蛋白相互作用(例如受体

-配体相互作用),还有可研究小分子-蛋白或细胞-蛋白的相互作用。这种方法不需要标记蛋

白(荧光标记或同位素标记),还可以实时定量分析这些相互作用的亲和力、热力学、动力

学特性。SPR 是分析动力学和亲和力的金标准。

690SPR 咖啡,熬夜读文献的时候用

EMSA

蛋白瞄着核酸,我们又瞄着那些蛋白

电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift AssayEMSAzui初用于检测 DNA 结合蛋白与

相应的 DNA 序列结合的情况,可做定性和定量分析,包括细胞核中的转录因子(如 NF-kB 

的活性等等,现在也常用于研究 RNA 结合蛋白和相应的 RNA 序列相互作用。

691这些分析用酶联免疫吸附实验(EenzymeLinked ImmunosorbentAssayELISA)也可以做,原 

理差不多。

EMSA,德国家居品牌,休息区的椅子可以吗?

PCR

把小树养大才能更好地招风

转录因子激活并和靶基因结合之后,该基因就被激活。PCRPolymerase Chain Reaction)或

692Real Time PCR 可以把特定的 DNA 序列大幅扩增,便于检测活性基因的表达情况。

PCR,用途很广啊

ELISA

追踪到天涯海角!

如果要看看细胞外如何,比如细胞培养上清液或体液中的某种蛋白质分泌情况,则通常选用

ELISA,从而获知相应基因的活性。 

 

 

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