作者：子非鱼

免疫组化（IHC），此种大气上档次的实验自然深得科研者的宠爱。然而做过该实验的人

都知道，IHC 看似容易，但其花样百出的问题总是让实验汪们的精神备受摧残，苦不堪言。

本文就对免疫组化进行抽丝剥茧的剖析，还其一片净土。

675IHC 反应实验流程

IHC 常见的 8 大疑问

Q1：冰冻切片和石蜡切片如何取材？

Answer: 冰冻切片取材可分为两种情况：

676677

1）动物灌流固定：如小鼠心脏灌流，首先采用预冷的 1×PBS 灌流冲洗直至血液全部放出，

随后灌注 4%PFA 直至小鼠僵直，而后解剖获取组织，于 4℃、4%PFA 中固定 1h 左右，1×PBS

洗 5 次（30min/次），25%蔗糖溶液脱水 12h 左右包埋即可。

2）直接取材：直接选择新鲜组织进行冰冻切片，此时不需要进行抗原修复。缺点：切出的

片子含水量会比较多，形成冰晶影响结果，而且后期的丙酮固定也会改变细胞的形态。

石蜡切片：动物组织取材（灌流与否都可以，并不影响后续的操作）后，置于 10%福尔马林

溶液中固定 3-4 天后，脱水，包埋，即可进行石蜡切片操作。

Q2:石蜡切片和冰冻切片的区别比较

Answer: 1）石蜡切片制备过程较复杂，抗原活性差，但切片薄（3-5μm），便于观察细胞的细

微结构，且常温保存即可，非常方便。2）冰冻切片较厚（8-12μm），操作简单，抗原活性好，

但是保存时间短，且一定放在-80℃的低温冰箱中。

Q3：一抗的选择要点是什么？

Answer：1）一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对低；而多克

隆抗体特异性弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可通过封闭来避

免）。2）抗体的比例可依据抗体说明书或 western blot 的抗体比例来做即可。3）对于组织样 

本，一般要在 37℃孵育 1-2h 或 4℃冰箱孵育过夜（效果zui佳，且拿出后需 37℃复温 45min），

并保持湿盒里的湿度来防止抗体蒸发。对于难以着色的，在第二天还需将湿盒置于室温孵育。Q4：如何选择封闭血清？

Answer：封闭血清一般是和二抗同一来源，可封闭非特异性结合位点，降低背景噪音。也可

使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗的来源一致。

Q5：DAB 显色时间如何把握？

Answer：可选择一张阳性的片子，用计时器精确计时在显微镜下判断出具体时间后，再对所

有片子进行显色，采用相同的时间来界定。一般如果抗体浓度适宜，操作无误，10 分钟内肯

定能够显色，如果超过该时间，说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。显色时间越短，

则说明抗体浓度高或抗体孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。

Q6：IHC 复染时间的选择？

Answer：苏木素复染时间一般为 5min 左右，可调整，染色时间太浅，可延长时间，反之缩

短时间；随后进行盐酸酒精分化，数秒即可，自来水洗，zui后置于氨水中返蓝。

Q7：免疫组化的结果如何分析？

Answer：1）必设对照组。如阴性、阳性及自身对照。

678由表中可知，只有 6、7 实验结果有意义。1-5 均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因

ICH 技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，则必须重复实验或换用抗体。

2）阳性着色细胞计数法。在 40 倍光镜下，随机选择不重叠的 10 个视野，人工或机器计

数阳性着色细胞，每组 3-6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

3）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用

image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

4）分级法。免疫组化的半定量一般分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧

光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，

强（+++）=3。至少随机观察 5-10 个 HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3

计算出数值；总数值<1.0 者为（+），1.0-1.5 者为(++), >1.5 者为(+++)。

679Q8：IHC 常见的疑难杂症有哪些？

Answer：

680免疫组化（IHC）的实战经验

1.把要做的切片先分好，做几个抗体可分几盒，不正常组织与正常组织要分开。其余做预实

验用。

2.选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。

6813.试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。如：肝组织生物素含量高，S-P 试剂盒生物素含

量也高，故不能配合使用。

4.每次开始做时，都必须先清点实验的必需品是否齐全。想好可能发生的意外，并先想好补

救措施。当抗体不够用的情况下，原先买的抗体zui好不要用完，留做可能需要的验证试验。

新的抗体要尽量同公司，同批号。

5.烤片（单一或综合）程度要适情况而定，可中途拿出甩一甩，尽可能先放在烤箱里烤 3 小

时以上。切勿把片烤得太久了。程度刚好，脱蜡效果才会好。注意做好不同条件的切片标记。 

注意温度稳定，再烤片。

6.二甲苯脱蜡。温度过低时，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，或者可把片放在二甲苯里一

起加热脱蜡，这样效果会更好；若温度适宜，那还是在室温下脱蜡，要不可能会适得其反。

时间也是适情况而定。

7.高压修复时，要注意稀释比例，修复液的种类（EDTA 不可以重新进行利用，可能发生交叉

作用），PH 值等。高压锅内压力未降至正常时不可打开，压力正常后可多放会儿，能更好的

利用余压，把握程度。若是多次修复，每次都需先把锅内热水倒掉，换冷水，保证条件的可

重复性。

8.抗体反复冻融可使效价降低。抗体要防止污染。不可用塑料保存，塑料可吸附抗体。抗体

稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于 PBS（其他稀释液，注意 PH 值，PBS 为偏中碱性）稀

释的抗体zui好要当天使用。稀释比例恰好为佳，注意前带和后带效应。

6829.吹干封片时不能有泡泡。若是没封好，可进行二甲苯、酒精脱树胶，吹干再次封片，但镜 

下效果会明显变差。因而，若没必要，zui好不要再次脱胶。DAB 显色需用中性树胶封片，AEC

（易溶于有机溶剂）需用水性胶封片。

10.刚封完的载玻片会移动，故切片还没干时，尽量不要碰到盖玻片，可避免树胶溢出，片的

整体效果不好。

附录：临床上常用免疫组化指标

通常恶性肿瘤，免疫组化耐药预后标记（共 4 个 marker）为：P-gp，GSTπ，TOPOII，Ki-67。

而乳腺癌免疫组化耐药预后标记（共 7 个 marker）为：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，

PR，C-erbB-2。

6836846856866875.2 ELISA

一句话知晓实验方法怎么选？WB、SPR、

688ELISA…

作者：麦子

在分子生物学实验室里的玩法，无非就是用某种特定的刺激物（如细胞活素）去刺激一些细

胞或组织，让它们 high 起来，然后分析细胞对这些外源刺激物的反应，检测细胞内哪条信

号通路被激活或失活，或者什么蛋白被分泌出来。这里面就有很多种方法，哪种zui合适，关

键看你要检测这个反应的哪个方面的特性。

WB

建立蛋白质的个人档案

一个典型的免疫印迹实验（Western Blot，WB）可检测信号通路中某种蛋白质的特性、表达

和分布，分析容量大、敏感度高、特异性强。

但 至 于 蛋 白 - 蛋 白 相 互 作 用 则 要 用 另 一 种 更 复 杂 的 方 法 ， 即 免 疫 共 沉 淀 法 （ Co

immunoprecipitation，Co-IP），它接近细胞内的生理情况，是以成为经典方法。

689WB 影视，实验做累了可以用

SPR

想知道 Ta 和 Ta 能有多亲密？

表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）除了研究蛋白-蛋白相互作用（例如受体

-配体相互作用），还有可研究小分子-蛋白或细胞-蛋白的相互作用。这种方法不需要标记蛋

白（荧光标记或同位素标记），还可以实时定量分析这些相互作用的亲和力、热力学、动力

学特性。SPR 是分析动力学和亲和力的金标准。

690SPR 咖啡，熬夜读文献的时候用

EMSA

蛋白瞄着核酸，我们又瞄着那些蛋白

电泳迁移率实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）zui初用于检测 DNA 结合蛋白与

相应的 DNA 序列结合的情况，可做定性和定量分析，包括细胞核中的转录因子（如 NF-kB ）

的活性等等，现在也常用于研究 RNA 结合蛋白和相应的 RNA 序列相互作用。

691这些分析用酶联免疫吸附实验（EenzymeLinked ImmunosorbentAssay，ELISA）也可以做，原 

理差不多。

EMSA，德国家居品牌，休息区的椅子可以吗？

PCR

把小树养大才能更好地招风

转录因子激活并和靶基因结合之后，该基因就被激活。PCR（Polymerase Chain Reaction）或

692Real Time PCR 可以把特定的 DNA 序列大幅扩增，便于检测活性基因的表达情况。

PCR，用途很广啊

ELISA

追踪到天涯海角！

如果要看看细胞外如何，比如细胞培养上清液或体液中的某种蛋白质分泌情况，则通常选用

ELISA，从而获知相应基因的活性。