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干货 | 免疫组化结果分析之独门绝招

发布时间:2020-03-24浏览:126次

作者:毛博

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很多时候,我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分

析,得出理想的结果。这实在是一件憾事。

其实,免疫组化结果分析的 protocol 教科书和实验手册上面都有。今天主要谈谈应该注意的

一些事项和技巧,并且有独门绝招献上,都是干货哟。

对照染色

和做实验的时候必须设立对照组一样,免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫

组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照,阴性组织对照,阴性试剂对照,自身对照。

一般来说,有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。

定位

抗原表达必须在特定部位。如 LCA 应定位在细胞膜上;CK 应定位在细胞浆内;PCNA p53

蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色,不能视为确切的阳性结果。有

可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办?这就要用到上一段提到的对照染色了。

半定位

现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话,就只好赶鸭

子上架,用肉眼定一下量了。因为人为主观性比较强,所以只能称作半定量。免疫组化的半

定量一般就分为三级:弱(+),中(++),强(+++)。以绿色免疫荧光为例,则表现为浅绿

色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱(+=1,中(++=2,强(+++=3。至少随

机观察 5-10 HPF。然后根据(+% x 1 +++% x 2 ++++% x 3 计算出数值;总数值

<1.0 者为(+),1.0-1.5 者为(++), >1.5 者为(+++)图像分析仪

如果要进行精确定量的话,就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一介绍

了。其实毛博最想隆重推荐的是一款图像分析软件:Image J。毛博当年在米国做博士猴的时

候,就是用的这款软件。这是 NIH 开发的免费软件。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有

余了。现在已经开发到了 1.50 版。网上可以免费下载。其界面非常简洁,如下图所示。

现在,根据一个实例来看看如何用 Image J 来进行图像分析。如下图所示,我们有一张细胞

的免疫荧光染色的照片。那么,如何用 Image J 来计数细胞的个数呢?

671首先,要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下:Image→Type→16-bit。转换成黑白图像

后,将要计数的部分用高亮标示出来。步骤如下:Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标,

直到所有的细胞被标示出来。

672有时候 2 个细胞靠得比较紧密,会被计数为 1 个细胞。这个时候可以采用 Image J 的水洗功

能。步骤如下:Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示,这些是本来计数成一个

的细胞,经过水洗之后,更加精确地被计数成了 2 个细胞。

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然后,就可以正式开始分析了。步骤如下:Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之

前,还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞,那么 Size 项里面选择“0-infinity”

Circularity 的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。

最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像,所以就是

每个细胞的面积。然后计数了一共有 72 个细胞,总面积为 21286.00,平均大小为 295.64免疫组化是个苦活,时间长,步骤多,还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦染出了漂

亮的片子,最后都希望得出自己想要的结果。以上介绍了一些自己的心得体会。希望广大的

实验狗们都能做出自己想要的结果,早点发文章。 

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