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Northern Blot原理及实验方法

发布时间:2020-03-03浏览:617次

Northern Blot原理及实验方法 

原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而将在凝胶中的位置转移

到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。

 

用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。  

实验方法: 

[仪器、试剂、材料] 

(一)仪器恒温水浴箱,电泳仪,凝胶成像系统,真空转移仪,真空泵,UV交联仪,杂交

炉,恒温摇床,脱色摇床,漩涡振荡器,分光光度计,微量移液器,电炉(或微波炉),离

心管,烧杯,量筒,三角瓶等。 

(二)材料总RNA样品或mRNA样品,探针模板DNA(25 ng),尼龙膜 

(三)试剂:NorthernMax Kit(Cat. # 1940,Ambion, Inc.),琼脂糖,DEPC, X光底片,

底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-free 

Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,双氧水,灭菌水等。 

 

[方法与步骤] 

1.用具的准备: 

180度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用

双氧水浸泡过夜,用DEPC水冲洗,干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。 

 

2.用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子,电泳槽,刀片等,

然后用DEPC水冲洗二次,去除RNAZap。 

 

3.制胶:  

1. 称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中,加入32.4mlDEPC水后,微波炉加热至琼脂糖完

全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分) 

 2. 在通风厨中加入3.6ml 的10*Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。注意尽量避

免产生气泡。 

3. 将熔胶倒入制胶板中,插上梳子如果胶溶液上存在气泡,可以用热的玻璃棒或其它方

法去除,或将气泡推到胶的边缘。注:胶的厚度不能超过0.5cm。 

4.胶在室温下完全凝固后,将胶转移到电泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer盖

过胶面约1cm,小心拔出梳子。(配制250ml 1×MOPS Gel Running buffer,在电泳过

程中补充蒸发的buffer。) 

5.检查点样孔。 

 

4. RNA样品的制备 

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB(终浓度为10ug/ml)。

混匀后,65℃空气浴15min。短暂低速离心后,立即放置于冰上5min。 

 

5.电泳: 

1.将RNA样品小心加到点样孔中。 

2.在5V/cm 下跑胶(5x14cm)。在电泳过程中,每隔30min 短暂停止电泳,取出胶,混

匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。 

3.紫外灯下,检验电泳情况,并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要

让胶在紫外灯下曝光太长时间。 

 

 

6.转膜 

1.用3%双氧水浸泡真空转移仪后,用DEPC水冲洗。 

2.用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏,用DEPC水冲洗二次。 

3.连接真空泵和真空转移仪,剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的

5mm),膜在Transfer buffer浸湿5分钟后,放置在多孔渗水屏的适当位置。 

4.盖上塑胶屏,盖上外框,扣上锁。 

5.将胶的多余部分切除,切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔,并至少盖过边缘约2mm,以

防止漏气。 

6.将胶小心放置在膜的上面,膜与胶之间不能有气泡。 

7.打开真空泵,使压强维持在50~58mbar;立即将transfer buffer加到胶面和四周。每

隔10min在胶面加上1ml transfer buffer,真空转移2小时。 

8.转膜后,用镊子夹住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒,去除残余

的胶和盐。 

9.用吸水纸吸取膜上多余的液体后,将膜置于UV交联仪中自动交联。 

10.将胶和紫外交联后的膜,在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间) 

12.将膜在-20℃保存。 

7.探针的制备 

1.在1.5ml离心管中配制以下反应液:模板DNA(25 ng)    1ul 

Random Primer 2ul灭菌水 11ul总体积:14ul 

2.95°C加热3分钟后,迅速放置于冰冷却5min。 

3.在离心管中按下列顺序加入以下溶液: 

10×Buffer 2.5ul 

dNTP Mixture 2.5ul 

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul 

Exo-free Klenow Fragment 1 ul 

4.混匀后(25ul), 37°C下反应30分钟。短暂离心,收集溶液到管底。 

5.65°C加热5min使酶失活。    

8.探针的纯化及比活性测定: 

1.准备凝胶:将1g凝胶加入30ml的DEPC水中,浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶

数次,以除去可溶解的葡聚糖。 

2.取1ml一次性注射器,去除内芯推扞,将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住,在注射器

中装填Sephadex G-50凝胶。 

3.将注射器放入一支15ml离心管中,注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟,凝

胶压紧后,补加Sephadex G-50凝胶悬液,重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度

处 

4.100ul STE缓冲液洗柱,1600g离心4min。重复3次。 

5.倒掉离心管中的溶液后,将一去盖的1.5ml离心管置于管中,再将装填了Sephadex G-50

凝胶的注射器插入离心管中,注射器口对准1.5ml离心管。 

6.将标记的DNA样品加入25 ul STE,取出0.5ul点样于DE8 paper上,其余上样于层

析柱上。 

7.1600g离心4min,DNA将流出被收集在去盖的离心管中,而未掺入DNA的dNTP则

保留在层析柱中。取0.5ul己纯化的探针点样于DE8-paper. 

 8. 测比活性。  

 

 

9.预杂交: 

1.将预杂交液在杂交炉中68℃预热,并漩涡使未溶解的物质溶解。 

2.加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb杂交液),42℃

预杂交4 hr。 

 

10.探针变性: 

1.用10 mM EDTA将探针稀释10倍。 

2.90℃热处理稀释后探针10min后,立即放置于冰上5min。 

3.短暂离心,将溶液收集到管底。 

 

11.杂交: 

1.加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中,混匀后,将探针加到预杂交液中。 

2.42℃杂交过夜(14~24hr)。杂交完后,将杂交液收集起来于-20℃保存。 

 

12.洗膜:  

1.低严紧性洗膜:加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗

膜溶液),室温下,摇动洗膜5min两次。  

2.高严紧性洗膜: 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml

洗膜溶液),42℃ 摇动洗膜20min两次。  

 

13.曝光: 

1. 将膜从洗膜液中取出,用保鲜膜包住,以防止膜干燥。 

2. 检查膜上放射性强度,估计曝光时间 

3. 将X光底片覆盖与膜上,曝光 

4. 冲洗X光底片,扫描记录结果。 

 

14.去除膜上的探针:将200ml 0.1%SDS(由DEPC 水配制)煮沸后,将膜放入,室温

下让SDS冷却到室温,取出膜,去除多余的液体,干燥后,可以保存几个月。 

 

15.杂交结果  

 

操作应该小心,但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse

酶,以免样品的降解。转膜时,注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡 

 

 

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