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RNA干扰实验

发布时间:2020-03-03浏览:719次

                                                             RNA干扰实验

(如需详细资料,请联系超博科技小凌)

一、磷酸钙转染法

【实 理】

磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙

有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮

作用进入靶细胞,被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达,也可整合到靶细胞的染色体

上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 

【仪器、材料和试剂】

(一)仪器、用具

CO2培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒

等。 

(二)材料

呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3

CsCl纯化的表达质粒DNA

(三)试剂

1.完全培养液 

DMEM 90ml

FCS 10ml

22M CaCl2,过滤除菌,-20℃保存备用

32×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0

KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19

HEPES 5.0

葡萄糖 1.0

NaOHpH6.95,过滤除菌后,-20℃保存备用。

【方法与步骤】

1.在10cm的培养板上接种1×106BALB/c 3T3细胞

第二天进行转染

2.准备CaPO4沉淀

2.1 准备两组试管

A管中加入: 15μg质粒DNA

69μl 2M CaCl2 

460μl重蒸水

B管中加入: 550μl 2×HEBS 

2.2 用巴斯德吸管将 A 管中的溶液缓慢地逐滴加入在 B 管中,同时用另一吸管吹打 B 管溶

液,整个过程需缓慢进行,至少需持续12min 

2.3室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。

3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中,轻轻晃动(此过程需尽快完成)。

 

4. 5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr

5. 除去培养液,加入10ml完全培养液培养细胞1-6天(依具体情况而定)。

6. 收集细胞进行基因活性的检测,或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。

【注 项】

1.在整个转染过程中要保持无菌操作。

2.在实验中使用的各种试剂都必须小心校准,保证质量。

3.质粒DNA CsCl纯化,乙醇沉淀后的DNA应保持无菌,在无菌水或Tris- EDTA

溶解。

4.沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2

溶液时需用空气吹打,以确保形成尽可能细小的沉淀物,因为成团的DNA不能有效地黏附

和进入细胞。

二、电穿孔和电融合技术

[实验原理]

当细胞置于非常高的电场中,细胞膜就变得具有通透性,能让外界的分子扩散进细胞内,这

一现象称为电穿孔。运用这一技术,许多物质,包括DNARNA、蛋白质、药物、抗体和

荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法,电穿孔已被广泛用于各种细胞类型,包括

细菌、酵母、植物和动物细胞;而且,它还能作为注射方法(称为电注射),把各种外源物

质引入活细胞。与其他常用的导入外源物质的方法相比,电穿孔具有很多优点。首先,不必

象显微镜那样使用玻璃针,不需要技术培训和昂贵的设备,可以一次对成百万的细胞进行注

射。第二,与用化学物质相比,电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三,因为电穿孔是一

种物理方法,较少依赖细胞类型,因而应用广泛。实际上,对大多数细胞类型,用电穿孔法

基因的转移效率比化学方法高得多。 

除了能使细胞膜具有通透性,让外界的分子扩散入胞液中以外,高强度的电场脉冲也能引起

细胞融合,这一现象叫做电融合。然而,在用电脉冲融合前必须使细胞相互紧密接触,这一

电融合方法在原生质融合制取杂交植物,胚胎细胞相互融合制备动物克隆方面非常有用,尤

其在制取杂交瘤细胞制备单克隆抗体方面用处很大。几个实验室已证明使用电场电融合效率

比常规的化学融合方法高10100倍,近来,贴壁细胞的电融合还被用来研究细胞融合时

细胞的骨架成分和细胞器的动力学重排。

[仪器、材料和试剂]

(一)仪器:

脉冲发生器,样品池:一个盛细胞的容器和两个平行的金属电极,CO2 培养箱,离心机,

显微镜,微量移液器,镊子,剪刀,三角瓶,吸管,毛细管,离心管等。 

(二)材料:

(三)试剂:

穿孔介质(PM):15mmol/L磷酸钾 1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖(或甘露醇)

10mmol/L HEPES 调节pH7.3

融合介质(FM):1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇 2mmol/L HEPES 调节pH

7.3

[方法与步骤]

一.悬浮细胞的电穿孔法:

1电穿孔进行基因转移

电穿孔可用于将多种不同类型的分子载入活细胞中,操作步骤非常相似。以下我们用基因转

移作为例子。载入其他的分子可按以下相同步骤进行,只需把外源DNA换页所需分子即可。

 

1.1 使细胞在适宜的培养基中生长,用胰酶处理,收获对数生长中期的细胞,并用腺酶处

理。

1.2 在穿孔介质(PM)中至少洗一次。洗细胞时,在台式离心机上1000rpm离心3分钟,

使得悬浮细胞沉降。然后,去掉上清液,在新的介质中重新悬浮细胞。

1.3 计数细胞,在PM 中,浓缩细胞为大约1千万细胞/ml

1.4 DNA 加到细胞悬液中,充分混合,使 DNA 均匀分散,用吸管吸一定体积的细胞

-DNA混合液到装有电极的灭菌小样品池中。

1.5 在电穿孔装置上设置输出电压和脉冲宽度(脉冲宽度是指数衰减函数的时间常数,即

τ=RCC 是电容,R 是样品的电阻)。假如设备是 CD 脉冲型发生器,设定电容和并联电

阻,以达到合适的τ值。 

1.6 将小池放进盛样品的池中,启动电穿孔装置,供给所需的电脉冲。

1.7 电处理后,向小池加1ml普通培养基,将细胞混合液从小池转移到组织培养容器(培

养皿或培养孔)中,再加入一些培养基使之后的培养基体积适量。然后,将样品细胞放回孵

育箱中使之在正常条件下生长。

1.8 在测定转移基因的表达量前电穿孔细胞各自培养的时间不同。

2检测电穿孔效率和细胞存活率

2.1 除用罗丹明偶联葡聚糖(1mg/ml)(分子探针)代替 DNA 外,将罗丹明偶联葡聚糖

引入目标细胞的方法如前所述。

2.2 电穿孔后,用培养基洗涤细胞两次,去掉胞外的荧光葡聚糖。 

2.3 电穿孔后30min,向细胞悬液中加30μl台盼蓝,孵育2min,然后用培养基洗涤。

2.4 1000rpm下离心3min,收集细胞,将细胞重悬于PM中,终体积100μl

2.5 将一滴细胞液(30μl)置于干净载玻片上,用盖玻片盖好,在显微镜下检测细胞,测定

摄取荧光标记葡聚糖的百分数。

2.6 在亮视野镜片下,死细胞可因染成蓝色检测出(摄取了台盼蓝),测定细胞存活的百分

数。

2.7 在各种电场设定值下重复实验,画出摄取葡聚糖率和细胞存活率对电穿孔参数的曲线。

这一曲线就将显示对特定细胞类型电穿孔的zui优条件。

二.悬浮生长细胞的电融合 

融合悬浮细胞的步骤与电穿孔的很类似,只是在进行高强度的电场脉冲前后,必须用低幅、

高频电场使细胞排成一条链。

1 用融合介质(FM)洗悬浮细胞两次,然后悬于 FM 中。洗涤细胞时,在台式离心机上

1000rpm下离心3分钟,得到细胞沉淀,弃去上清液将细胞悬于新鲜FM介质中。

2 将悬浮细胞转移到相应的融合室内。假如要使两种不同的细胞彼此融合,转移前要充分

混合。

3 启动介电电泳场,其振幅通常小于200V/cm,频率在2MHz以内,用显微镜检测细胞是

否排成一条链,调节振幅和频率以达到zui佳效果。

4 让介电电泳场开约 1 分钟后关掉,立即应用融合脉冲,其振幅数量级为 1kV/cm。脉冲

宽度小于1ms。在进行融合脉冲后立即再次启动介电电泳场,常规让其开启约2分钟。

5 关掉介电电泳场,让细胞在样品池中静置10分钟。

6 去掉FM,用普通培养基再次洗涤细胞。

7 将细胞转移到培养皿,加入普通培养基,在培养箱一般条件下培养。

[注意事项]

1 Zui优组分依使用的特定细胞种类而有明显的变化。如果努力优化电压和脉冲宽度电穿孔

结果仍不令人满意,就应尝试改变穿孔介质。

2 影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关,为达到zui高效率,必须收集对数生

长中期的细胞。

1.纯化siRNA 

在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗

脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和盐离子。注

意:化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化(即PAGE胶纯化)。 

2.避免RNA酶污染 

微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,

所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等,此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非

常重要。

3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 

通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。

为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。 

4.避免使用抗生素 

抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条

件。这种情况下,可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到zui佳转染效果。

 

5.选择合适的转染试剂 

针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同,选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA

验的成功至关重要。 

 

6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件 

对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞

(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降

低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

7.通过标记siRNA来优化实验 

荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA

胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染

与靶蛋白表达的下调结合起来。

RNAi研究的一般技术路线是:

 

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