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mRNA的分离纯化

发布时间:2020-03-03浏览:394次

                                         

                                                      mRNA的分离纯化

(内有数据图,如有需要请联系超博小凌)

mRNA的分离纯化

【实验原理】

真核生物的mRNA分子是单顺反子,是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白

质归根到底都是 mRNA 的翻译产物,因此,高质量 mRNA 的分离纯化是克隆基因、提高

cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5 g RNA,理论

上认为每克细胞可分离出510mg RNA。其中 rRNA75%~ 85%,tRNA10%~

16%,而mRNA仅占 1%5%,并且mRNA分子种类繁多,分子量大小不均一,表达丰

度也不一样。

         真核生物 mRNA 有特征性的结构,即具有 5’端帽子结构(m7G)和 3’端的

poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的 3’端存在 20~300 个腺苷酸组成的 polyA

尾,通常用 polyA+)表示,这种结构为真核 mRNA 分子的提取、纯化,提供了极为方

便的选择性标志,寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论

基础就在于此。

        一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3 末端含有多poly(A)尾巴结构特

性设计的。当总 RNA 流经寡聚(dT)(即 oligo(dT))纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,

mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,

经过两次oligo(dT)纤维素柱,即可得到较纯的mRNA

        目前常用的mRNA的纯化方法有:

       1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离mRNA的标准方法;

       2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的 

RNA溶液中并使mRNA与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA

复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素;

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        3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。

         本实验应用方法(1)进行mRNA的分离纯化。

 

【试剂与器材】

(一)试剂

1 0.1mol/L NaOH ,每组200mL 

2 寡聚OligodT-纤维素

3 加样/洗涤缓冲液10.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组 250mL

0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS

4 洗涤缓冲液 20.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组 250mL

10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS

        配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)NaClEDTApH 8.0)的母液,经高压消毒

后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至 65℃时,加入经 65℃温育(30min

10%SDS至终浓度。

5 5 mol/L NaCl,每组10mL

6 3 mol/L NaAc pH5.2,每组10mL

7 RNase双蒸水(DEPC),每组100mL

8 70%乙醇,每组10mL

 

注意:溶液5 6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜,溶液1 3 4 8则用经0.1% DEPC

处理过的无RNase双蒸水配制,Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后,zui好能够按一

次实验所需的分量分装成多瓶(如10ml50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次

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操作造成对溶液的污染。

 

(二)器材

1 恒温水浴箱

2 冷冻高速离心机

3 紫外分光光度计

4 巴斯德吸管

5 玻璃棉

6 5ml一次性注射器

 

【操作方法】

(一) oligo(dT)纤维素的预处理

1 0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。 

2 将悬浮液装入填有经 DEPC 水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积

0.5-1.0mL,用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。 

3 3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素,直到流出液的pH 值小于8.0

4 将处理好的 oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出,用适当的柱床洗涤缓冲液 I 悬浮,浓

度约为0.1g/mL,保存在4℃待用。

 

(二) RNA浓度的调整

1 把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中,如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL

则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL,总 RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。把

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RNA溶液置于65℃水浴加热5 分钟,然后迅速插在冰上冷却。

2 加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L

 

(三) mRNA的分离

1 mRNAOligo(dT)-纤维素结合:用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素,按下表取适

量的 oligo(dT)-纤维素到 RNA 样品中,盖上盖子,颠倒数次将 oligo(dT)-纤维素与 RNA

混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。

RNA

(mg) 

 寡聚Oligo(dT)-纤维素

(mL)

 洗涤缓冲液12

(mL)

洗脱体积

(mL) 

<0.2  0.2 1.0   1.0

 0.2-0.5  0.5  1.5  1.5

 0.5-1.0  1.0  3.0  3.0

 1.0-2.0  2.0  5.0  5.0

 

2 转移:取 1 5ml 的一次性注射器,取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端,并把它

固定在无 RNase 的支架上,再把 oligo(dT)-纤维素/RNA 悬浮液转移到注射器,推进塞子

直至底部,把含有未结合上的 RNA 液体排到无 RNase 的离心管中(保留至确定获得足够

mRNA)。

3 洗涤:根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1,温和振荡,充分重新悬浮

mRNA-oligo(dT)-纤维素,推进塞子,用无 RNase 的离心管收集洗出液。测定每一管的

OD260,当洗出液中OD0时准备洗脱。

4 洗脱:根据上表直接用注射器慢慢吸取适量(2-3 倍柱床体积)的洗脱缓冲液 2 或无

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RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素,推进塞子以1/31/2柱床

体积分管收集洗脱液。

5 测定每一管的OD260,合并含有RNA的洗脱液组分于4℃,2500g,离心2-3分钟,

上清转移至新的离心管中,去掉残余的oligo(dT)-纤维素。

6 沉淀:洗脱液中加入 1/10 体积的3mol/L NaAc pH5.2, 再加入2.5 倍体积的冰

冷乙醇,混匀后,-2030分钟或放置过夜。

7 离心收集:12000g, 4℃离心15 分钟,小心弃去上清,mRNA沉淀此时往往看不见,

70%乙醇漂洗沉淀,12000g, 4℃离心5 分钟,小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,

或真空干燥10分钟。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水,立即用于cDNA

合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。

8 定量:测定OD260OD280,计算产率以及OD260/OD280的比率(同上一实验)。

 

【注意事项与提示】

1 整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。

2 提取的总RNA必须完整,不能被降解,这是mRNA质量的先决条件。

3 RNAOligo(dT)-纤维素的比例要适当,过量的总RNA,容易造成mRNA不纯。

 

4 RNA 溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热 5 分钟,这一步很重要,其

作用(1)破坏 mRNA 的二级结构,特别是 poly(A+)尾处的二级结构,使 poly(A+)尾充

分暴露,提高poly(A+)RNA回收率;(2)解离mRNArRNA的结合。加热后应立即插

入冰上,以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。

5 应注意mRNA不能被DNA污染,即使是1 ppm DNA污染,也可严重影响实验结果。

6 mRNA 制备后,可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无 DNA 污染。提取的

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mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状,无明显区带,但大部分的mRNA应在1-2.0kb

范围内(如下图)。一般来说,经过一次纯化分离的 mRNA 还会有微量的 rRNA 残留,但

一般来说不会对后续实验造成很大的影响,如果样品充足,可将经过一次纯化分离的mRNA

再纯化一次,进一步提高其纯度。

 

3.1   mRNA变性琼脂糖凝胶电泳示意图

Lane 1, 0.247.5kb RNA分子量Maker;

Lane 2, 老鼠肝脏总 RNA;

Lane 3, 老鼠肝脏mRNA

7 为防止 mRNA 降解,应避免多次冻融,可将 mRNA 少量分装后保存。另外,如果有

低温冰箱,zu好在 -70℃~ -80℃保存。 也可将mRNA70%乙醇中-70℃保存一年以上。

 

8 寡聚(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并

加入 0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用 NaOH、灭菌 ddH2O

层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

9 一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA

量的1%-2%

 

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【实验安排】

1 一天:试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase 处理(0.1%DEPC

浸泡或高温干烤)。

2 二天:进行(一)、(二)和(三)1-6

3 三天:进行(三)7和变性琼脂糖凝胶电泳捡测mRNA

4 为了避免由于保存时间过长造成的RNA降解,zui好能将总RNA提取、mRNA的分离

纯化、RT-PCRcDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。

 

其他:

引物的设计一般遵循的原则:

1)典型的引物20-24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非

目的序列位点的可能性。但是太长的引物可能会与错误配对序列杂交降低了特异性,同时因

比短序列杂交慢,从而降低了产量。

2)设计 5'端和中间区为 G C,且 GC 含量为 50~60%的引物,以增加引物的稳定性

及其与目的序列杂交的稳定性。

33'末端尽量不要富含 GC。设计引物时保证在zui 5 个核苷中含有 3 A T。但因为

3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸,为了避免3'末端的错误配对,所以末端尽量

避免为核苷A

4)在引物对3'末端尽量避免互补序列以免形成引物二聚体,抑制扩增。如果引物序列可能

产生内部二级结构会破坏引物退火稳定性,也要尽量避免。

此外,目的序列上并不存在的附加序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物 5'

而不影响特异性。

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        有时候,仅有有限的序列信息可供用于引物设计。比如,如果仅知道氨基酸序列,

可以设计简并引物,同时使用较高的引物浓度(1μM 3μM),因为许多简并混合物中的

引物不是特异性针对目的模板。

        为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简

并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。不要在引物的 3'端使用简

并碱基,因为3'zui3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR

 

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