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干货│Transwell 总失败,是哪个环节出了 问题?

发布时间:2019-10-16浏览:217次

                                          干货│Transwell 总失败,是哪个环节出了 问题? 
                                                                 作者:毛博 
Transwell 技术在细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭中经常被应用到,相对来说, 它的操作还是较简单,重复性也比较好,可还是有小伙伴叫苦不迭:为啥我总是失败呢?毛
博今天就来帮你对症下药,一一梳理,看看是哪出了问题。  
  
“杯子”孔径用对了吗? 
Transwell 技术的名称来自于就是一个叫 Transwell 的小杯子,可以放在细胞培养板里面。有 不同形状,不同大小,不同选择。但无论如何,它的关键部分都是一样的,那就是杯子底层
的那张膜。这张膜一般是聚碳酸酯膜,带有微孔,孔径大小有 0.1-12.0 µm。根据不同的实 验需要,需要选用不同的孔径,共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究, 应用的孔径是有区别的。 
 

(1).细胞共培养: 
 
将细胞 A 种于上室,细胞 B 种于下室,可以研究细胞 B 分泌或代谢产生的物质对细胞 A 的 影响。应选择﹤3.0 µm 孔径。因为﹤3.0 µm 孔径,细胞不会迁徙通过。 
 
(2).细胞趋化: 
 
①细胞 B 对细胞 A 的趋化作用:将细胞 A 种于上室,细胞 B 种于下室,可以研究细胞 B 分 泌或代谢产生的物质对细胞 A 的趋化作用。 
 
②趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化 因子对细胞的趋化作用。 
应选择 5.0、8.0、12.0 µm 孔径,上室细胞可穿过膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反 映下室成分对上室细胞的趋化能力。 
 
(3).细胞迁移: 
 
上室种细胞,一般是具备迁移能力的肿瘤细胞,下室加入 FBS 或某些特定的趋化因子,肿瘤 细胞会向营养成分高的下室跑。应选择 8.0、12.0 µm 孔径,计数进入下室的细胞量可反映细 胞的迁移能力。 

(4).细胞侵袭: 
 
常用 8.0、12.0 µm 孔径,原理和方法与细胞迁移实验类似。 

检查过程细节小纰漏 
 
① 重复使用的问题: 
 
Transwell 小室按照要求,都是一次性使用的。不过因为价格昂贵,其实洗洗泡泡还是可以重 复用的。用完后用胰酶和 75%酒精泡,室温凉干。再次使用前用紫外里里外外都照上 30 min。 就可以啦。 
 
② 上层培养液: 
 
上层培养液采用无血清培养基,为维持渗透压,需加入 0.05%-0.2% BSA。 

③ 下层培养液: 
 
下层培养液采用含 5%-10% FBS 的培养基,具体浓度根据细胞侵袭力而定,侵袭力弱的细 胞可适当提高 FBS 浓度。 
 
④ 细胞培养板:  
常用的细胞培养板有 6 孔板、12 孔板、24 孔板等。细胞培养板没什么特殊要求,普通的细 胞培养板就可以。但要注意,细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相配套。不要一个大 一个小,不配套啊。 
 
⑤ 细胞计数:  
那么,细胞迁移到下室了,如何计数和比较呢?用 PBS 缓冲液洗细胞 1-2 次,吸尽残余的液 体,加入甲醇固定 20 分钟,弃固定液,加入结晶紫染液,染色 10-20 分钟,弃染色液,用 PBS 冲洗 干净即可。如下图所示,哪组迁移的多,哪组迁移的少,是不是一目了然了呢?

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