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一文教你读懂PCR荧光定量!

发布时间:2022-03-14浏览:157次

  PCR荧光定量的原理:
 
  以探针法PCR荧光定量为例:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时,探针完整地结合在DNA任意一条单链上,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,检测不到荧光信号;PCR扩增时,Taq酶将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
 
  传统的PCR进行检测时,扩增反应后需要进行染色处理及电泳分离,并且只能作定性分析,不能准确定量,易造成污染出现假阳性,使其应用受到限制。实时定量PCR技术不仅实现了对模板的定量,且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特点,使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。
 
  在PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,这样的直线即是基线,这条线是可以自动生成也可以手动设置的。之后反应会进入指数增长期,这个期间扩增曲线具有高度重复性,在该期间,可设定一条荧光阈值线,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上。
 
  PCR荧光定量是具有划时代意义的技术,具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点,不仅应用于基因表达解析,还广泛应用于SNP分型解析、物种鉴定、病毒和病原菌的检测、转基因食品的定量分析、导入基因拷贝数的解析等诸多领域。
 

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