当前位置:首页 > 技术文章 > 大肠杆菌转化实验(热击法)

大肠杆菌转化实验(热击法)

发布时间:2020-03-13浏览:258次

大肠杆菌转化可以:(1)将重组 DNA 分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制,增殖和表达,

以获得目的基因;(2)验证大肠杆菌感受态细胞效果;(3)用于分子生物学其他研究。

1 原理:

质粒 DNA 粘附在细菌细胞表面,经过 42°C 短时间的热击处理,促进吸收 DNA.然后在非

选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生

长。

2 器材:

旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,干

式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体 LB-Amp),超

净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。

3 材料和试剂:

质粒 DNA,重组 DNA,培养基(不加抗菌素),LB 培养基(加抗菌素),无菌 ddH2O,

IPTG,X-gal。

4 实验准备:

无菌 ddH2O,1.5ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),

20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用 N,N-二甲基甲酰胺配)。

5 操作步骤:

(1)事先将恒温水浴的温度调到 42℃。

(2)从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100μl)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰

上,冰浴 5~10min。(3) 加入 5μl 连接好的质粒混合液(DNA 含量不超过 100ng),轻轻震荡后放置冰上

20min。

(4)

轻轻摇匀后插入 42℃水浴中 1~2min 进行热休克,然后迅速放回冰中,静置 3~5min。

(5) 在超净工作台中向上述各管中分别加入 500μl LB 培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,

然后固定到摇床的弹簧架上 37℃震荡 1h.

(6) 在超净工作台中取上述转化混合液 100~300μl,分别滴到含合适抗菌素的固体 LB

平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍

等片刻,待其冷却后再涂)。

(7)

如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加 40μl 2% X-gal,

8μl 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。

(8) 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在 37℃恒温培养箱中 30-60min 直到表面的液

体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入 37℃恒温培养箱过夜。

(9) 在被细菌污染的桌面上喷洒 70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。

(10)观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。

Contact Us
  • 联系QQ:277124344
  • 联系邮箱:277124344@qq.com
  • 联系电话:13760660301
  • 联系地址:广州市天河区明旭街5号

扫一扫  微信咨询

© 2020 广州市超博科技有限公司 版权所有  备案号:粤ICP备19162636号

技术支持:化工仪器网    管理登陆    GoogleSitemap

服务热线
13760660301

微信服务号