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基因定点突变

发布时间:2020-03-10浏览:200次

一、定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

二、定点突变的原理

通过设计引物,并利用 PCR 将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的 PCR

产物,在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定

就行了。

三、引物设计原则

引物设计的一般原则不再重复。

突变引物设计的特殊原则:

(1)通常引物长度为 25~45 bp,我们建议引物长度为 30~35 bp。一般都是以要突

变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为 11-12 bp。若两边引物太短了,

很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要 11-12 个 bp 才能与模板搭上,而这种突变

PCR 要求两边都能与引物搭上,所以两边尽量各设至少 12 个 bp,并且合成多一条反向互

补的引物。

(2)如果设定的引物长度为 30 bp,接下来需要计算引物的 Tm 值,看是否达到 78℃

(GC 含量应大于 40%)。

(3)如果 Tm 值低于 78℃,则适当改变引物的长度以使其 Tm 值达到 78℃(GC 含

量应大于 40%)。

(4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

(5)尽量使用经过纯化的引物。

Tm 值计算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注:L:引物碱基数;% of GC:引物 GC 含量。

四、引物设计实例

GCG→ACG 为例:

5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’

(1)首先设计 30 bp 长的上下游引物,并将 A (T)设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’

(2)引物GC含量为40%,

L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5

(Tm=0.41×40-675/30+81.5)。通过计算可以看出其 Tm 低于 78℃,这样的引物是不合

适的,所以必须调整引物长度。

(3)重新调整引物长度。

Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物两端加 5mer(斜体下划线处),这样引物的 GC 含量为 45.7%,L 值为 35,将

这两个数值带入 Tm 值计算公式,得到其 Tm 为 80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),

这样的引物就可以用于突变实验了。

五、突变所用聚合酶及 Buffer

引物和质粒都准备好后,当然就是做 PCR 喽,不过对于 PCR 的酶和 buffer,不能用平

时的,我们做 PCR 把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个 K,所以要用那些 GC buffer 或

扩增长片段的 buffer,另外,要用保真性能较好的 PFU 酶来扩增,防止引进新的突变。除了使用基因定点突变试剂盒,如 Stratagene 和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵。可以

使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金pai快速 taq 酶、Takara 的 PrimeSTARTM HS DNA

polymerase。

六、如何去掉 PCR 产物

zui简单的方法就是用 DpnI 酶,DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板

一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用

的是甲基化缺陷型的菌株),而 PCR 产物都是没有甲基化的,所以 DpnI 酶能够特异性地切

割模板(质粒)而不会影响 PCR 产物,从而去掉模板留下 PCR 产物,所以提质粒时那些菌

株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI 处理的时间尽量长一点,最少一个小时吧,尽量能有两三个小时,因为如果模板

处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败。

七、如何拿到质粒

直接把通过 DpnI 处理的 PCR 产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提

出质粒,拿去测序,验证突变结果。

八、图示九、定点突变操作步骤

[A] 诱导突变基因(PCR 反应)以待突变的质粒为模板,用设计的引物及 Muta-direct™

酶进行 PCR 扩增反应,诱导目的基因突变。

1. 设计点突变引物。

[注]参考引物设计指导

2. 准备模板质粒 DN A

[注]用 dam+型菌株(例如 DH5α 菌株)作为宿主菌。在 end+型菌株中常有克隆数低的现

象,但是对突变效率没有影响。提取质粒 DNA 时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。

3. [选项]对照反应体系(50μl 反应体系)

10×Reaction Buffer

5μl

pUC18 control plasmid(10ng/μl,total

20ng)

2μlControl primer mix(20pmol/μl)

2μl

dNTP mixture(each 2.5mM)

2μl

dH2O

38μl

Muta-direct™ Enzyme

1μl

4. 样品反应体系(50μl 反应体系)

10×Reaction Buffer

5μl

Sample plasmid(10ng/μl,total

20ng)

2μl

Sample primer (F)(10pmol/μl)

1μl

Sample primer (R)(10pmol/μl)

1μl

dNTP mixture(each 2.5mM)

2μl

dH2O

38μl

Muta-direct™ Enzyme

1μl

5. PCR 反应条件

[注]按如下参数设置 PCR 扩增条件。

Cycles

Temperature

Reaction Time

1cycle

95℃

30sec15cycle

95℃

30sec

55℃

1min

72℃

1min per plasmid Kb

6. PCR 扩增反应完成后冰育 5 分钟,然后置于室温(避免反复冻融)。

[注] 按下列提供的 PCR 条件进行扩增,控制 PCR 循环数。注意当突变点位点超过 4 个时

会发生突变率降低的现象。

Mutation

Cycles

1~2Nucleotide

15cycles

3Nucleotides

18cycles

[B] 突变质粒选择

PCR 反应结束后使用 Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒 DNA。

1. 准备 PCR 反应产物

2. 加入 1μl(10U/μl)Mutazyme™酶 37℃温育 1 小时。

[注]当质粒 DNA 用量过多时 Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们

建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低,可以适当延长反应时间

或增加 Mutazyme™酶用量。

[C]转化

反应完毕后在质粒 DNA 上会产生缺口,当把这个质粒 DNA 转入 E.coli 中时请选择 dam+

型菌株,例如 DH5α。

1. 将 10μl 样品加到 50μl 感受态细胞里,然后放置在冰上 30 分钟。

2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。序列分析

通常当 LB 平板上出白色菌落则表明发生了突变。

 

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