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动物基因组 DNA 的提取

发布时间:2020-03-10浏览:123次

动物基因组 DNA 的提取

[实验原理]

在 EDTA 和 SDS 等去污剂存在下,用蛋白酶 K 消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳

动构基因组 DNA,用此方法得到的 DNA 长度为 100-150 kb,适用于 L 嘴菌体构建基因组

文库和 Southern 分析。

通过本实验了解并掌握提取基因组 DNA 的原理和步骤,以及相对分子质量较大的 DNA

的 琼脂糖凝胶电泳技术。

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器

1.台式离心机

2.玻璃匀浆器

3.高压灭菌锅

4.恒温水浴

(二)材料

1.1.5mL 微量离心管

2.微量取样器和吸头

3.无菌过滤器(一次性)

4.10 mL 注射器

5.鼠肝

6.三羟甲基氨基甲烷(Tris)

7.十二烷基硫酸钠(SDS)

8.乙二胺四乙酸(EDTA)9.蛋白酶 K

10.RNA 酶

11.DNA 相对分子质量标准物,DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物

(三)试剂

1、1.5 mol/L NaCl

2、0.5 mol/L Tris·HCI pH8.0

3.0.5 mol/L EDTA pH8.0

4.3 mol/L NaAc pH5.2

以上均高压灭菌。

5.蛋白酶 K 10mg/mL 配好后用一次性过滤器过滤,-20 保存(教师配制)

6.组织匀浆液 100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/

LEDTA(pH8.0)

7.酶解液 200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH

8.0),200~g/mL 蛋白酶 K,1%SDS

8.无 DNA 酵的 RNA 酶 : 将胰 RNA 酶溶解于 10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol

/L NaCl 溶液中,浓度 l0mg/mL,于 100℃水浴处理 15min,以降解 DNA 酶,缓慢冷

却到室温,-20℃保存

9.TE 缓冲液 :10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0)

10.平衡酚(pH8.0):氧仿:异戊醇=25:24:1<体积比)

11.氧仿:异戊醇=24:l(体积比)

12.5xTBE 5.4gTris,2.75g 硼酸 2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到 100mL;

13.6x 上样缓冲液 o.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液14.λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP)21 227,5148,4 973,4 268,

3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125

[实验步骤]

本实验在无液氮的条件下,铡备鼠肝 DNA,与有液氮条件下相比,产量和质量都有所下

降。整个操作过程中,应尽量避免 DNA 酶的污染,特 g4 注童动作温和,减少对 DNA 的

机械捌伤。

1、取 0.2g 鼠肝,用冰冷的生理盐水洗 3 次,然后置于 2.0mL 匀浆掖中,用玻璃匀浆器匀

浆至无明显组织块存在(冰浴操作,切匆将细胞破碎,可镜检观察)。

2、将组织细胞移至 1.5ml 离心管中,50000rpm 离心 30-60sec,(尽可能在低温下操作),

弃上清,若沉淀中血细胞较多,可再加入 1 倍于细胞体积的匀浆液洗一次。

3、沉淀加 0.8mL 无菌水迅速吹散,分两管,再加 0.4mL 酵解液,翻转混匀(动作一定要

轻)55℃水浴处理 12-18 h;

4、沉淀加 RNase 至终浓度 200µg/mL,37℃水浴 1 h;

5、加入等体积酚/lv仿/异戊醇抽提一次,(慢慢旋转混勾,倾斜使两相接触面增大)。4℃、

10min、10000rpm 离心;

6、有时如果 DNA 含量过高,水相在下层,实验时应注意观察。用扩口吸头移出含 DNA

的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀),加等体积氧仿/异戊醇,4℃、

10 000rrpm 离心 10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重复 1.6 操作)。

7、用扩口吸头小心吸出上层含 DNA 的水相,加 1/10 体积的 NaAc,小心混匀(要充分),

再向每管中加入 2.5 倍体积的无水乙醇,-20 过夜。8、12 000rpm 离心 19min,弃上清,75%冷乙醇洗涤一次,12000rpm 离心 15min 室

握温干燥(不要大干,否则 DNA 不易溶解),加入适量 TE 缓冲液,存放于 4℃,轻摇溶解过

夜,即可得 到实验动物基因组 DNA。

9、电泳鉴定 DNA,由于基因组 DNA 相对分子质量较大,用 0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,

先在底部锦一层 1%的支持胶,凝固后再铺上一层 0.3%琼脂糖凝胶,插上梳子(枚子不能瑾

到的支持胶)。取 1.5µL 溶解的 DNA、1µL 上样缓冲液和 35µl 无菌水混匀后小心上样(可在

另一孔加 DNA 相对分于质量标准),观察基因组 DNA 大小,用溴化乙锭染色观察结果。

[注意事项]

1、操作过程尽量在低温下进行,避免 DNA 降解。

2、琼脂糖凝胶脆弱,应小心操作。

3、提取得到的基因组 DNA 应为单一条带,DNA 降解可形成弥散带型。

 

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