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cDNA文库构建

发布时间:2020-03-09浏览:217次

cDNA文库构建 

(字体说明:FANG-仿,DI-,suan- )

cDNA文库

[原理]

cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNACDNA

组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA

开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与 mRNA 相互补的 DNA 链,然后除掉

mRNA,以DI一条DNA链为模板复制出DI二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入

原核或真核载体。

 

      cDNA文库的构建

分为六个阶段:

阶段1:反转录酶催化合成cDNADI一链

阶段2cDNADI二链的合成

阶段3cDNA的甲基化

阶段4:接头或衔接子的连接

阶段5Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA

阶段6cDNA与λ噬菌体臂的连接

 

[阶段1:反转录酶催化合成cDNADI一链]

1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNADI一链的合成:

poly(A)+RNA (1μg/μl)                         10μl

寡核苷suan引物(1μg/μl)                          1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37)                    2.5μl

1mol/L KCl                                    3.5μl

250 mmol/L MgCl2                               2μl

dNTP溶液(含4dNTP,每种5mmol/L        10μl

0.1 mol/L DTT                                   2μl

RNase抑制剂(选用)                          25单位

H2O                                      48μl

2.当所有反应组在 0℃混合后,取出 2.5μl 反应液转移到另一个 0.5ml 微量离心管内。在

这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP400 Ci/mmol, 10mCi/ml)。

3.大规模和小规模反应管都在37℃温育1h

4.温育接近结束时,在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA,然后将

反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min,然后转移至冰上。

5.参考《分子克隆实验指南》DI三版附录8所述方法,测定0.5μl小规模反应物中放射性

总活度和可被三氯乙suanTCA)沉淀的放射性活度。此外,用合适的 DNA 分子质量参

照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。

6.按下述方法计算cDNADI一链的合成量(推算方法略):

    [掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的 cDNADI一链(μg)

7.尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。

 

[阶段2cDNADI二链的合成]

1.将下列试剂直接加入大规模DI一链反应混合物中:

10 mmol/L MgCl2                                70μl

2 mol/L Tris-HCl (pH7.4)                           5μl

10 mCi/ml[α-32P] dCTP400 Ci/mmol            10μl

1 mol/L (NH4)2SO4                               1.5μl

RNase H (1000单位/ml)                            1μl

大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml)            4.5μl

温和振荡将上述试剂混合,在微量离心机稍离心,以除去所有气泡。在16℃温育2~4h

2.温育结束,将下列试剂加到反应混合物中:

β-NAD (50 mmol/L)                               1μl

大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml)            1μl

室温温育15min

3.温育结束,加入1μl含有4dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。反应混合

物室温温育15分钟。

4.取出3μl反应物,按步骤78描述的方法测定DI二链DNA的质量。

5.将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中,用酚:氯FANG和氯FANG分别抽提混合

物一次。在 0.3 mol/L(pH5.2)suan钠存在下,通过乙醇沉淀回收 DNA,将 DNA 溶解

90μl TE(pH7.6)溶液中。

6.将下列试剂加到DNA溶液中:

10×T4多核苷suan激酶缓冲液                10μl

T4多核苷suan激酶(3000单位/ml            1μl

室温温育15分钟。

7.测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度,并按分子克隆实验指南》DI三版附

8所述方法测定1μlDI二链合成产物中能被三氯乙suan沉淀的放射性活度。

8.用下面公式计算DI二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已掺入到DNADI一链种的

dNTP的量。

[DI二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA DI二链合

成量/μg

x表示cDNADI一链量。CDNADI二链合成量通常为DI一链量的70~80%

9.用等量酚:氯FANG对含有磷suancDNA(来自步骤6)的反应物进行抽提。

10  Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaClTE(pH7.6)溶液进行平衡,然后通过离

子柱层析将未掺入的dNTPcDNA分开。

11  加入0.1倍体积的3mol/Lsuan钠(pH5.2)和 2倍体积的乙醇,沉淀柱层析洗脱下

来的 cDNA,将样品置于冰上至少 15 分钟,然后在微量离心机上以高速度 4℃离心

15分钟,回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查,是否所有放射性都沉淀下来。

12  70%乙醇洗涤沉淀物,重复离心。

13  小心吸出所有液体,空气干燥沉淀物。

14  如果需要用

Eco R I甲基化酶对cDNA进行甲基化,可将cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)

溶液中。另外,如果要将cDNA直接与

Not I

Sal I接头或寡核苷suan衔接子相连,可

cDNA悬浮在 29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后,尽快进行cDNA

成的下一步骤。

 

[阶段3cDNA的甲基化]

1.在cDNA样品中加入以下试剂:

2 mol/L Tris-HCl (pH8.0)                      5μl

5 mol/L NaCl                                2μl

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)                       2μl

20 mmol/L S-腺苷甲硫氨suan                    1μl

H2O                                  96μl

2.取出两小份样品(各2μl)至0.5ml微量离心管中,分别编为1号和2号,置于冰上。

3.在余下的反应混合液中加入2μl Eco R I 甲基化酶(80 000单位/ml),保存在0℃直至

步骤4完成。

4.再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品(各 2μl)至 0.5ml 微量离心管中,分别编

3号和4号。

5.在所有四小份样品(来自步骤2和步骤4)加入100 ng质粒DNA500 ng的λ噬菌

DNA。这些未甲基化的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率。

6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃温育1h

7.于68℃加热15min,用酚:氯FANG抽提大体积反应液一次,再用氯FANG抽提一次。

8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/Lsuan钠(pH5.2)和2倍体积的乙醇,混

匀后贮存于-20℃直至获得小样反应结果。

9.按下述方法分析4个小样对照反应:

a.     在每一对照反应中分别加入:

0.1 mol/L MgCl2                      2μl

10× Eco R I 缓冲液                    2μl

H2O                           20μl

b.     2号和4号反应管中分别加入20单位

Eco R I

c.     四个对照样品于37℃温育1h,通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

10  微量离心机以高速离心15min(4)以回收沉淀cDNA。弃上清,加入200μl 70%

乙醇洗涤沉淀,重复离心。

11  用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇,在空气中晾

干沉淀,然后将DNA溶于29μl TEpH8.0)。

12  尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段。

 [阶段4:接头或衔接子的连接]

cDNA末端的削平

1cDNA样品于68℃加热5 min

2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂:

5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液    10μl

dNTP溶液,每种5 mmol/L               5μl

H2O                             50μl

3.加入1~2单位T4 噬菌体 DNA聚合酶(500单位/ml),37℃温育15min

4.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0),以终止反应。

5.用酚:氯FANG抽提,再通过Sephadex G-50离心柱层析,除去未掺入的dNTP

6.在柱流出液中加入0.1倍体积的3 mol/L suan钠(pH5.2)和二倍体积的乙醇,样品于

4℃至少放置15 min

7.在微量离心机上以高速离心15 min(4),回收沉淀的cDNA。沉淀经空气干燥后

溶于13μl10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).

 

接头-衔接子与cDNA的连接

8.将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中:

10×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液       2μl

800~1000 ng的磷suan化接头或衔接子          2μl

T4噬菌体DNA连接酶(105 Weiss单位/ml  1μl

10 mmol/L ATP                             2μl

混匀后,在16℃温育 8~12h

9.从反应液中吸出0.5μl贮存于4℃,其余反应液于68℃加热15min以灭活连接酶。

[阶段5Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA]

Sepharose CL-4B柱的制备

1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部,用无菌剪刀剪去露在

吸管外的棉花并弃去,再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。

2.将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连,将吸管宽端浸于含有0.1 mol/L NaCl

TEpH7.6)溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸,直至吸

管内充满缓冲液,用止血钳关闭软管。

3.在吸管宽端接一段乙烯泡沫管,让糊状物静置数分钟,放开止血钳,当缓冲液从吸管滴

落时,层析柱亦随之形成。如有必要,可加入更多的 Sepharose CL-4B,直至填充基

质几乎充满吸管为止。

4.将几倍柱床体积的含0.1 mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后,关闭柱子

底部的软管。

 

依据大小分离回收DNA

5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体,将cDNA加到柱上(体积50μl

或更小),放开止血钳,使cDNA进入凝胶。用50μl TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA的微

量离心管,将洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaClTE(pH7.6)充满泡沫管。

6.用手提式小型探测器监测 cDNA 流经柱子的进程。放射性 cDNA 流到柱长 2/3 时,开

始用微量离心管收集,每管2滴,直至将所有放射性洗脱出柱为止。

7.用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。

8.从每一管中取出一小份,以末端标记的已知大小(0.2kb~5kb)的 DNA 片断作标准参

照物,通过1%琼脂凝胶电泳进行分析,将各管余下部分贮存于-20℃,直至获得琼脂糖

凝胶电泳的放射自显影片。

9.电泳后将凝胶移至一张Whatman 3MM滤纸上,盖上一张Saran包装膜,并在凝胶干

燥器上干燥。干燥过程前 20min 30min 50℃加热凝胶,然后停止加热,在真空

状态继续干燥1~2h.

10  -70℃加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光。

11  cDNA长度≥500bp的收集管中,加入0.1倍体积的3mol/Lsuan钠(pH5.2)和

二倍体积的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀,用微量离心机于4℃以12 000g

离心15min,以回收沉淀的cDNA

12  DNA溶于总体积为20μl10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。

13  测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于

λ噬菌体臂相连接的DNA总量。

[选定组分的总活度值(cpm)/掺入到DI二链的活度值(cpm)]*2xμg cDNADI二链合成量

=可用于连接的cDNA

[阶段6cDNA与λ噬菌体臂的连接]

1.按下述方法建立4组连接-包装反应:

连接 A(μl) B(μl) C(μl) D(μl)

λ噬菌体DNA(0.5μg/μl) 1.0 1.0 1.0 1.0

10×T4DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0

cDNA 0 ng 5 ng 10 ng 50 ng

T4噬菌体DNA连接酶(105 Weiss单位/ml 0.1 0.1 0.1 0.1

10 mmol/L ATP 1.0 1.0 1.0 1.0

H2O 10 10 10 10

连接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA储存于-20℃。

2.按包装提取物厂商提供的方法,从每组连接反应物中取5μl包装到噬菌体颗粒中。

3.包装反应完成后,在各反应混合物中加入0.5ml SM培养基。

4.预备适当的大肠杆菌株新鲜过夜培养物,包装混合物做 100 倍稀释,各取10μl 100

μl涂板,于37℃或42℃培养8~12小时。

5.计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑,连接反应 A 不应产生重组噬菌斑,而连接反应 BC

D应产生数目递增的重组噬菌斑。

6.根据重组噬菌斑的数目,计算cDNA的克隆效率。

7.挑取 12 个重组λ噬菌体空斑,小规模培养裂解物并制备 DNA,以供适当的限制性内切

suan酶消化。

8.通过 1%琼脂凝胶电泳分析 cDNA 插入物的大小,用长度范围500bp~5

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