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cDNA文库构建
(字体说明:FANG-仿,DI-第,suan-酸 )
cDNA文库
[原理]:
cDNA文库不同于基因组文库,被克隆DNA是从mRNA反转录来源的DNA。CDNA
组成特点是其中不含有内含子和其他调控序列。从而做cDNA克隆时应是先从获得mRNA
开始,在此基础上,通过反转录酶作用产生一条与 mRNA 相互补的 DNA 链,然后除掉
mRNA,以DI一条DNA链为模板复制出DI二条DNA链(双链);再进一步把此双链插入
原核或真核载体。
cDNA文库的构建
分为六个阶段:
阶段1:反转录酶催化合成cDNADI一链
阶段2:cDNADI二链的合成
阶段3:cDNA的甲基化
阶段4:接头或衔接子的连接
阶段5:Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA
阶段6:cDNA与λ噬菌体臂的连接
[阶段1:反转录酶催化合成cDNADI一链]
1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNADI一链的合成:
poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl
寡核苷suan引物(1μg/μl) 1μl
1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl
1mol/L KCl 3.5μl
250 mmol/L MgCl2 2μl
dNTP溶液(含4种dNTP,每种5mmol/L) 10μl
0.1 mol/L DTT 2μl
RNase抑制剂(选用) 25单位
加H2O至 48μl
2.当所有反应组在 0℃混合后,取出 2.5μl 反应液转移到另一个 0.5ml 微量离心管内。在
这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP(400 Ci/mmol, 10mCi/ml)。
3.大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4.温育接近结束时,在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA,然后将
反应管转移到冰上。大规模反应管则在70℃温育10 min,然后转移至冰上。
5.参考《分子克隆实验指南》DI三版附录8所述方法,测定0.5μl小规模反应物中放射性
总活度和可被三氯乙suan(TCA)沉淀的放射性活度。此外,用合适的 DNA 分子质量参
照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
6.按下述方法计算cDNADI一链的合成量(推算方法略):
[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的 cDNADI一链(μg)
7.尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。
[阶段2:cDNADI二链的合成]
1.将下列试剂直接加入大规模DI一链反应混合物中:
10 mmol/L MgCl2 70μl
2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl
10 mCi/ml[α-32P] dCTP(400 Ci/mmol) 10μl
1 mol/L (NH4)2SO4 1.5μl
RNase H (1000单位/ml) 1μl
大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl
温和振荡将上述试剂混合,在微量离心机稍离心,以除去所有气泡。在16℃温育2~4h。
2.温育结束,将下列试剂加到反应混合物中:
β-NAD (50 mmol/L) 1μl
大肠杆菌DNA连接酶(1000~4000单位/ml) 1μl
室温温育15min。
3.温育结束,加入1μl含有4种dNTP的混合物和2μl T4噬菌体DNA聚合酶。反应混合
物室温温育15分钟。
4.取出3μl反应物,按步骤7和8描述的方法测定DI二链DNA的质量。
5.将5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反应物中,用酚:氯FANG和氯FANG分别抽提混合
物一次。在 0.3 mol/L(pH5.2)乙suan钠存在下,通过乙醇沉淀回收 DNA,将 DNA 溶解
在90μl TE(pH7.6)溶液中。
6.将下列试剂加到DNA溶液中:
10×T4多核苷suan激酶缓冲液 10μl
T4多核苷suan激酶(3000单位/ml) 1μl
室温温育15分钟。
7.测定从上面步骤4取出的3μl反应物中放射性活度,并按分子克隆实验指南》DI三版附
录8所述方法测定1μlDI二链合成产物中能被三氯乙suan沉淀的放射性活度。
8.用下面公式计算DI二链反应中所合成的cDNA量。要考虑到已掺入到DNADI一链种的
dNTP的量。
[DI二链反应中所掺入的活度值(cpm)/总活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA DI二链合
成量/μg
x表示cDNADI一链量。CDNADI二链合成量通常为DI一链量的70~80%
9.用等量酚:氯FANG对含有磷suan化cDNA(来自步骤6)的反应物进行抽提。
10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液进行平衡,然后通过离
子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。
11. 加入0.1倍体积的3mol/L乙suan钠(pH5.2)和 2倍体积的乙醇,沉淀柱层析洗脱下
来的 cDNA,将样品置于冰上至少 15 分钟,然后在微量离心机上以高速度 4℃离心
15分钟,回收沉淀DNA。用手提微型监测仪检查,是否所有放射性都沉淀下来。
12. 用70%乙醇洗涤沉淀物,重复离心。
13. 小心吸出所有液体,空气干燥沉淀物。
14. 如果需要用
Eco R I甲基化酶对cDNA进行甲基化,可将cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)
溶液中。另外,如果要将cDNA直接与
Not I或
Sal I接头或寡核苷suan衔接子相连,可
将cDNA悬浮在 29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后,尽快进行cDNA合
成的下一步骤。
[阶段3:cDNA的甲基化]
1.在cDNA样品中加入以下试剂:
2 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 5μl
5 mol/L NaCl 2μl
0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 2μl
20 mmol/L S-腺苷甲硫氨suan 1μl
加H2O至 96μl
2.取出两小份样品(各2μl)至0.5ml微量离心管中,分别编为1号和2号,置于冰上。
3.在余下的反应混合液中加入2μl Eco R I 甲基化酶(80 000单位/ml),保存在0℃直至
步骤4完成。
4.再从大体积的反应液中吸出另外两小分样品(各 2μl)至 0.5ml 微量离心管中,分别编
为3号和4号。
5.在所有四小份样品(来自步骤2和步骤4)加入100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌
体DNA。这些未甲基化的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率。
6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃温育1h。
7.于68℃加热15min,用酚:氯FANG抽提大体积反应液一次,再用氯FANG抽提一次。
8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙suan钠(pH5.2)和2倍体积的乙醇,混
匀后贮存于-20℃直至获得小样反应结果。
9.按下述方法分析4个小样对照反应:
a. 在每一对照反应中分别加入:
0.1 mol/L MgCl2 2μl
10× Eco R I 缓冲液 2μl
加H2O至 20μl
b. 在2号和4号反应管中分别加入20单位
Eco R I。
c. 四个对照样品于37℃温育1h,通过1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
10. 微量离心机以高速离心15min(4℃)以回收沉淀cDNA。弃上清,加入200μl 70%
乙醇洗涤沉淀,重复离心。
11. 用手提式微型探测器检查是否所有放射性物质均被沉淀。小心吸出乙醇,在空气中晾
干沉淀,然后将DNA溶于29μl TE(pH8.0)。
12. 尽可能快地进行cDNA合成的下一阶段。
[阶段4:接头或衔接子的连接]
cDNA末端的削平
1.cDNA样品于68℃加热5 min。
2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂:
5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl
dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl
加H2O至 50μl
3.加入1~2单位T4 噬菌体 DNA聚合酶(500单位/ml),37℃温育15min。
4.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0),以终止反应。
5.用酚:氯FANG抽提,再通过Sephadex G-50离心柱层析,除去未掺入的dNTP。
6.在柱流出液中加入0.1倍体积的3 mol/L 乙suan钠(pH5.2)和二倍体积的乙醇,样品于
4℃至少放置15 min。
7.在微量离心机上以高速离心15 min(4℃),回收沉淀的cDNA。沉淀经空气干燥后
溶于13μl的10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).
接头-衔接子与cDNA的连接
8.将下列试剂加入到已削成平末端的DNA中:
10×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 2μl
800~1000 ng的磷suan化接头或衔接子 2μl
T4噬菌体DNA连接酶(105 Weiss单位/ml) 1μl
10 mmol/L ATP 2μl
混匀后,在16℃温育 8~12h。
9.从反应液中吸出0.5μl贮存于4℃,其余反应液于68℃加热15min以灭活连接酶。
[阶段5:Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA]
Sepharose CL-4B柱的制备
1.用带有弯头的皮下注射针头将棉拭的一半推进1ml灭菌吸管端部,用无菌剪刀剪去露在
吸管外的棉花并弃去,再用滤过的压缩空气将余下的棉拭子吹至吸管狭窄端。
2.将一段无菌的聚氯乙烯软管与吸管窄端相连,将吸管宽端浸于含有0.1 mol/L NaCl的
TE(pH7.6)溶液中。将聚氯乙烯管与相连于真空装置的锥瓶相接。轻缓抽吸,直至吸
管内充满缓冲液,用止血钳关闭软管。
3.在吸管宽端接一段乙烯泡沫管,让糊状物静置数分钟,放开止血钳,当缓冲液从吸管滴
落时,层析柱亦随之形成。如有必要,可加入更多的 Sepharose CL-4B,直至填充基
质几乎充满吸管为止。
4.将几倍柱床体积的含0.1 mol/L氯化钠的TE(pH7.6)洗涤柱子。洗柱完成后,关闭柱子
底部的软管。
依据大小分离回收DNA
5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上层的液体,将cDNA加到柱上(体积50μl
或更小),放开止血钳,使cDNA进入凝胶。用50μl TE(pH7.6)洗涤盛装cDNA的微
量离心管,将洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaCl的TE(pH7.6)充满泡沫管。
6.用手提式小型探测器监测 cDNA 流经柱子的进程。放射性 cDNA 流到柱长 2/3 时,开
始用微量离心管收集,每管2滴,直至将所有放射性洗脱出柱为止。
7.用切仑科夫计数器测量每管的放射性活性。
8.从每一管中取出一小份,以末端标记的已知大小(0.2kb~5kb)的 DNA 片断作标准参
照物,通过1%琼脂凝胶电泳进行分析,将各管余下部分贮存于-20℃,直至获得琼脂糖
凝胶电泳的放射自显影片。
9.电泳后将凝胶移至一张Whatman 3MM滤纸上,盖上一张Saran包装膜,并在凝胶干
燥器上干燥。干燥过程前 20min 至 30min 于 50℃加热凝胶,然后停止加热,在真空
状态继续干燥1~2h.
10. 置-70℃加增感屏对干燥的凝胶继续X射线曝光。
11. 在cDNA长度≥500bp的收集管中,加入0.1倍体积的3mol/L乙suan钠(pH5.2)和
二倍体积的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀,用微量离心机于4℃以12 000g
离心15min,以回收沉淀的cDNA。
12. 将DNA溶于总体积为20μl的10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。
13. 测定每一小份放射性活度。算出选定的组分中所得到的总放射性活度值。计算可用于
λ噬菌体臂相连接的DNA总量。
[选定组分的总活度值(cpm)/掺入到DI二链的活度值(cpm)]*2xμg cDNADI二链合成量
=可用于连接的cDNA
[阶段6:cDNA与λ噬菌体臂的连接]
1.按下述方法建立4组连接-包装反应:
连接 A(μl) B(μl) C(μl) D(μl)
λ噬菌体DNA(0.5μg/μl) 1.0 1.0 1.0 1.0
10×T4DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0 1.0
cDNA 0 ng 5 ng 10 ng 50 ng
T4噬菌体DNA连接酶(105 Weiss单位/ml) 0.1 0.1 0.1 0.1
10 mmol/L ATP 1.0 1.0 1.0 1.0
加H2O至 10 10 10 10
连接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA储存于-20℃。
2.按包装提取物厂商提供的方法,从每组连接反应物中取5μl包装到噬菌体颗粒中。
3.包装反应完成后,在各反应混合物中加入0.5ml SM培养基。
4.预备适当的大肠杆菌株新鲜过夜培养物,包装混合物做 100 倍稀释,各取10μl 和100
μl涂板,于37℃或42℃培养8~12小时。
5.计算重组噬菌斑和非重组噬菌斑,连接反应 A 不应产生重组噬菌斑,而连接反应 B、C
和D应产生数目递增的重组噬菌斑。
6.根据重组噬菌斑的数目,计算cDNA的克隆效率。
7.挑取 12 个重组λ噬菌体空斑,小规模培养裂解物并制备 DNA,以供适当的限制性内切
核suan酶消化。
8.通过 1%琼脂凝胶电泳分析 cDNA 插入物的大小,用长度范围500bp~5
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