让细胞培养不再为难新手

                                                                       作者：毕老师 

细胞培养起初对于我这种“女汉子”性格的人来说，着实是枯燥的工作，因为面对的细胞， 它不会说话不会笑不能对你有任何回应，而且对于喜欢外科喜欢拿刀的我来说，细胞培养更 像是个内科医生做的事情，每天换液就如同换药，它污染了就需要上各种抗生素来“抢救” 它。。。。。。可是随着一天天的相处，一天天的用心体会，我渐渐发现原来细胞培养也是一项
十分有意思的工作，下面将我的一些经验分享给大家。 
 
换液： 
 
从培养箱中取出培养瓶； 
 
用吸液管将瓶的废液全部吸出（在培养瓶的左下角吸走液体，勿接触细胞），吸管丢弃。 
 
更新吸液管，从培养液贮存管中吸取新培养液，加入培养瓶，注意哦，千万不要直接冲洗细
胞，细胞们都娇滴滴的，容不得半点“风吹雨打”。吸出废液至加入新液之间一般不超过 5-10 秒钟，以免细胞因干燥而死亡。 
 
保留该吸管（节省一根是一根），用于吸取下一轮需要换液的同源细胞的废液，注意一定是
废液。 （同源细胞、无污染的几个培养瓶可用同一根吸管吸走或加入培养液。） 
 
  先换生长速度慢的细胞，再换生长速度快的（这似乎和我们平时“早起的鸟有虫吃”的原 则不同，长得快的要后吃饭，嘿嘿）；先换无污染的，再换有污染的。 

微生物污染处理： 
 
  每天到实验室，肯定是看我的“心肝宝贝儿”——细胞，害怕的事情莫过于 发现细胞污染了，那种心情就像母亲每天醒来看自己的孩子，结果发现孩子生病了一样焦急
难过。如何发现细胞污染呢？首先要在取出细胞后，先观察一下培养液的颜色，如果培养液 都能看出污染了，那这个细胞基本就无药可救了。 
 
  培养液肉眼看着正常，细胞就一定正常吗？答案是否定的。关键的还是要通过我们的
*神器——显微镜来观察，下面给大家看一些细胞污染的图片： 

  有微生物污染的一般均丢弃。如污染不严重而该细胞株较重要，则可试行治疗如下：尽
量吸净原培养液装在有盖的小瓶子里，盖好；用过吸管放桌下收集有污染物品的盒子里；用
Hanks 液或培养液洗涤 2 次（环形摇晃几周，再将液体吸走，放在有盖的瓶子里）；加入抗生
素。如为霉菌污染，则加抗霉菌素—两性霉素 B（Fugzone）终末浓度为 2.5 ug/ml。预防量减
半。 

  细胞污染不于细菌等微生物，当同时培养多种细胞，细胞与细胞间也会发生交叉污
染，这个时候我们可以用遗传霉素（Geneticin）终末浓度 100 ug/ml，如保存液为 1:30，则
在培养瓶/皿中每 3 ml 培养液加 0.1 ml Geneticin。 
 
单纯传代步骤： 
 
以 25 cm2 培养瓶（6 ml）为例，用 5 ml 吸管将原培养液吸出； 
 
用 2 ml 吸管吸取 D-Hanks 液 2 ml（12.5 cm2 培养瓶和 6 皿板用 1 ml）加入培养瓶，以洗清
血清，轻晃几次后吸出； 
 
用 2 ml 吸管吸加 TE 1/2（Trypsin 0.025% + EDTA 0.01%）2 ml，轻晃使之到达每个角落（一定
要照顾到各个角落啊，即使是冷宫的细胞娘娘也要照顾到），放入 37 °C 水浴，使贴皿细胞脱
落。 
观察时见细胞基本浮起，用 2 ml 吸管加 0.2 ml 血清中和，吸出瓶中的液体及细胞（即 2.2 
ml）。如按照 1:4 稀释传代，则 0.5 ml 传代（1.5 ml 保存或丢弃）加至 15 ml 离心管。该吸管
可保留再用。 

取等量的离心管作配对，进行离心（5 分钟，标记 60 处，即 1000-1500 转/分）； 
 
离心后用上一步骤保留的吸管将离心管中的上清液吸走；换一根 5 ml 吸管，吸取 6.5 ml 培
养液，加 5.5 ml 至培养瓶（12.5 cm2 培养瓶则吸取 4.0 ml 培养液，加 3 ml 至培养瓶），加 1 
ml 至离心管，用巴氏管适度吹打 5 次，全部吸出，水平横持巴氏管滴入培养瓶，保留 1-2 滴
加入血球计数板作计数。 
 
将培养瓶置于培养箱。 
 
  以上都是常规的操作，也是每个科研狗每天都要面对的工作，貌似枯燥无味，实则妙趣
横生，只要用心你会发现其实别有洞天。