人脐静脉内皮细胞

人脐静脉内皮细胞细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中解冻至管内残留一点冰屑。用75%酒精擦拭冻存管后，将内容物吸至一15ml无菌离心管中，逐滴加入预温至37℃的RPMI-1640培液4-5ml混匀，室温1500rpm离心10分钟弃上清。再用RPMI-1640培液4-5ml洗涤一次，离心后弃上清，加HUVEC*培养液4-5ml备用，每支HUVEC冻存管含细胞量为5×10个。

细胞接种和培养

1、细胞接种:

(1)、包被液:用去离水配制0.5%明胶溶液，过滤除菌。

(2)、培养瓶包被:取2-4个T25培养瓶，每个培养瓶加2-3ml0.5%明胶溶液，摇匀使包被液布满培养瓶底面，置37℃2小时或放置过夜。

(3)、接种细胞:接种前吸净包被液，按2500-5000个细胞/cm接种细胞(1支5×10个细胞可接种2-4个培养瓶)，每瓶加培养液3-5ml,摇匀后置37℃5%CO2培养箱内培养24小时，此时细胞已*贴壁，更换培养液后继续在37℃5%CO2培养箱内培养。

(4)、扩大培养:一般每周更换培养液2次，至细胞长至覆盖培养面的70-80%可进行传代或冻存。

消化细胞

消化液:用pH7.0-7.2的PBS或D-Hank'S液，分别配制0.25%胰酶液和0.02%EDTA-Na2液，用前按1:1混合。在细胞传代或冻存前先消化细胞。具体操作如下:吸净培养液，每瓶加消化液1ml，摇匀使其布满培养瓶细胞面。37℃消化2-5分钟。显微镜下看细胞回缩成圆形后，轻轻震动使绝大部细胞脱落后，每瓶加含10%FBS的RPMI-1640液的中和液4-5ml中和胰酶的消化作用，并用吸管轻轻吹打培养面使细胞*脱落后，吸至15ml无菌离心管内。4℃1500rpm离心10分钟弃上清，再用中和液洗涤细胞，离心弃上清，加适量RPMI-1640液，混匀后取10ul 细胞悬液加10ul台盼蓝混匀后作细胞计数，按需要做步骤四或五。

细胞传代

方法同步骤二。

人脐静脉内皮细胞细胞冻存

调整细胞数2-5×10个/ml，按含细胞的RPMI-1640液ml数，配制等量的冻存液。冻存液中FBS占80%，DMSO占20%。例:含细胞的RPMI-1640液为8ml，应配冻存液8ml，其中FBS为6.4ml,DMSO为1.6ml，混匀。置细胞悬液于冰浴中，逐滴加入冻存液，边加边摇动。加完后用吸管吹打混匀。于冰浴中分装细胞于冻存管中，1.8ml/管，再将冻存管置于冻存盒内置-80℃冰箱，24小时后转入液氮中保存。