小鼠小胶质细胞

小鼠小胶质细胞   主要试剂：

(1) PBS：用购自中山公司的PBS粉剂，每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，高压灭菌消毒。

(2) 0.25%胰蛋白酶消化液：使用时浓度为0.25%，含0.02%EDTA，制备时即取250mg胰酶和20mgEDTA溶于100mLPBS溶液，并在无菌操作台上用0.22um一次性过滤器过滤，50ml分装，4℃保存。

(3) 接种液配制：用DMEM-F12 基础培养90%，再加入10%胎牛血清，后按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL和100 U／mL，置于4℃冰箱保存。

（4) 抗生素：青霉素(80万U)和链霉素(100万U)在无菌操作台内以高压灭菌过的双蒸水溶解分别加入4ml灭菌水/青霉素，5ml灭菌水/链霉素)，配制成20万u/ml分装，置于-20℃冰箱保存，临用时4℃解冻，注意尽量避免反复冻融，并使培养基终浓度为100 u/ml。

（5）0.01% L-多聚赖氨酸溶液的配制：称量 10mg L-多聚赖氨酸，溶于 100ml 灭菌去离子水，0.22μm 正压滤器过滤分装，-20℃保存。

（6）0.4%台盼蓝溶液的配制

台盼蓝 4 g

PBS 少许（研磨）

PBS 定容至 100ml，滤纸过滤，室温保存。

（7）4%多聚甲醛的配制：

多聚甲醛 4 g

PBS 溶液 100ml

加热至 60℃，边滴加 1mol/L NaOH 边搅拌，至液体澄清。

（8）四噻唑兰溶液配制：

MTT 50mg

PBS 10ml

磁力搅拌 30min，灭菌 0.22µm 微孔滤膜过滤分装，4℃保存，两周有效。

实验步骤：

1.培养板的包被

（1）将盖玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘干。

（2）经 5%盐酸浸泡30min，自来水冲洗20min，三蒸水冲洗，浸泡过夜并烘干；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精灯烤干，放入 24 孔细胞培养板。

（3）用 0.01%的 L-多聚赖氨酸溶液包被培养皿和小玻片，37℃恒温孵育 4h 或常温过夜。

去除 L-多聚赖氨酸溶液，灭菌去离子水漂洗培养孔及小玻片，晾干备用。

2.小鼠小胶质细胞的混合培养

(1) 75%（体积分数）酒精消毒新生 24h 内的清洁级小鼠，在无菌条件下断头，剪开头皮及颅骨，取出脑组织，置于盛冷的pH7.2,无钙、镁的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。小鼠小胶质细胞