荧光定量技术已经很普遍，但对于接触它的人来说，总会遇到一些这样那样大大小小的问题，这些荧光定量实验中（染料法）的一些小技巧，相信你能用得上，助在PCR的路上一帆风顺，少走弯路。

　　荧光定量是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

　　荧光定量是实验室常用的实验。研究基因在mRNA表达水平,以及验证基因敲除后下游靶基因变化情况等等。

　　荧光定量的引物设计原则：

　　（1）引物长度一般在15~30碱基之间，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

　　（2）引物GC含量在40%~60%之间，Tm值接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，一般计算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值。

　　（3）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

　　（4）引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。

　　（5）引物扩增长度：一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp。