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荧光定量的引物设计原则是什么?

发布时间:2019-10-30浏览:117次

   荧光定量早已是各个分子生物学实验室常用的简单的实验技术。十年的变化很大。伴随着测序成本的降低和科研经费支持的增加,荧光定量实验天天都做,天天都要处理和分析数据。

  荧光定量技术已经很普遍,但对于接触它的人来说,总会遇到一些这样那样大大小小的问题,这些荧光定量实验中(染料法)的一些小技巧,相信你能用得上,助在PCR的路上一帆风顺,少走弯路。
  荧光定量是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
  荧光定量是实验室常用的实验。研究基因在mRNA表达水平,以及验证基因敲除后下游靶基因变化情况等等。
  荧光定量的引物设计原则:
  (1)引物长度一般在15~30碱基之间,过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
  (2)引物GC含量在40%~60%之间,Tm值接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度,一般计算公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值。
  (3)引物应具有特异性。引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。
  (4)引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性。
  (5)引物扩增长度:一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp。
  

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