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解析LncRNA调控肿瘤糖酵解重编程的作用及机制

发布时间:2020-04-06浏览:380次

1 AGPG被鉴定为作为代谢相关的LncRNA

为了发现对ESCC发育有显著影响的致癌LncRNA,我们首先从肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中鉴定出在ESCC组织中表达高于成对相邻正常组织的LncRNA。然后,我们根据log2差异倍数对这些LncRNA进行分类。接下来,我们建立了一个siRNA库,对于siRNA进行筛选,这些siRNAs还包含了TARGETplus上的专有双链化学修饰,以确保zui佳的链负载和干扰类似microRNA的种子活性,从而减少非目标效应。为了确定可能改变葡萄糖代谢的LncRNA,我们将siRNA文库转染到两个人ESCC细胞中,检测细胞活力和乳酸生成。我们发现14LncRNA可能是细胞增殖所必需的,10个参与乳酸的产生,8个可能参与细胞活力和葡萄糖代谢(图1a)。在这8个低分子RNA中,AGPG基因敲除显著降低了细胞活力和乳酸生成(图1b)。生物信息学分析显示,AGPG位于染色体1q32.1上,有3个外显子(1-5610447-1052611304-13488)。我们关注的是AC098934.2-201亚型,为了简单起见,我们将该亚型称为AGPG。然后,我们在人食管鳞癌细胞和正常食管上皮细胞(Het-1ANE-1)中验证了AGPG的表达shui平,我们发现肿瘤细胞的AGPGshui平明显高于正常细胞,ESCC细胞的AGPG拷贝数也增加(图1c,d),AGPG在其他ESCC细胞系中对细胞增殖和分泌乳酸的作用也得到进一步证实。

2 AGPG的表达与食管鳞癌预后的关系

 

与我们的生物信息学分析结果(图1e)一致,我们发现高AGPGshui平与ESCC患者的不利总体生存率相关(图1f)。与中值相比,我们将基因表达分为低表达或高表达:如果表达shui平高于中值,则将其分为高表达,而如果低于中值,则将其分为低表达。多因素分析也表明AGPGESCC患者的独立预后因素。根据TCGA数据库分析,AGPG在多种癌症中高表达,包括胃癌(GC)、结直肠癌(CRC)、肝癌、乳腺癌和肺癌。但在多形性胶质母细胞瘤(GBM)、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌等肿瘤组织中,其表达与正常组织无明显差异。此外,在肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌中,AGPGshui平也降低。与许多其他LncRNA类似,AGPG在不同癌症中具有组织特异性表达模式。接下来,我们进行qRT-PCRRNAScope原位杂交(ISH)检测AGPGESCCGCCRC组织中的表达。我们的结果显示AGPGESCCGCCRC组织中高度表达(图1g-i)。这些结果提示AGPG的失调与癌症的发展有着密切的关系。为了确定AGPG的亚细胞定位,我们用qRT-PCR方法检测了AGPG在胞质和细胞核中的表达。结果表明,AGPG主要定位于细胞核,部分定位于细胞质,RNAScope-ISHRNA荧光原位杂交进一步证实了这一点(图1j-l,补充图1i)。

 

3 AGPG促进细胞增殖和糖酵解

 

由于AGPG可能参与细胞增殖和乳酸生成,我们进一步研究了AGPG在细胞行为中的功能作用。KYSE150KYSE30细胞中的AGPG敲除显著抑制细胞增殖和菌落形成(图2a-d),AGPG敲除阻断G1/S细胞周期转换(图2ef)。我们还检测到了关键细胞周期蛋白,并观察到AGPG基因敲除显著增加了p27的表达,降低了CDK1的表达(图2g),但没有改变p21p53CDK3CDK6的表达。这些结果提示,AGPG可能通过调节p27等关键细胞周期蛋白和CDK1介导的G1/S进程来促进细胞增殖。为了验证AGPG在代谢重编程中的作用,使用细胞外流量分析仪测量ESCC细胞的细胞外酸化率(ECAR)(图2hi),证明AGPG基因敲除显著损害糖酵解,这与我们之前的筛选结果一致。为了进一步确定葡萄糖的代谢流量,我们检测了13C6葡萄糖孵育2 h后,ESCC细胞内13C标记的代谢中间产物的数量(图2j)。基于液相色谱和质谱(MS)的代谢组分析表明,AGPG基因敲除后糖酵解的细胞内代谢物(3-磷酸甘油酸、丙酮酸和乳酸)明显减少,进一步证实AGPG对葡萄糖转化为乳酸至关重要(图2k-m)。为了进一步确认AGPG的功能作用,我们使用CRISPR/Cas9基因组编辑系统生成了AGPG-CRISPR-KO细胞,结果显示AGPG CRISPR KO显著抑制ESCC细胞增殖和细胞周期进展。综上所述,我们的数据表明,AGPG在调节肿瘤代谢重编程和肿瘤生长方面具有重要的功能。

4 AGPGPFKFB3直接相关

 

为了剖析AGPG介导的代谢重塑的分子机制,我们尝试通过RNA pull-down分析和质谱分析来鉴定AGPG相关蛋白。通过比较AGPG结合蛋白和反义AGPG结合蛋白,发现非反义对照的sense-AGPGPFKFB3(图3a)有特异性的相互作用,如前所述,PFKFB3也主要位于细胞核内。通过发现AGPG直接结合到纯化His标记的重组PFKFB3(图3b)进一步证实了这一观察结果。AGPGPFKFB3之间的相互作用也通过RNA免疫沉淀(RIP)分析得到证实(图3c)。为了进一步研究AGPGPFKFB3在体内的相互作用,我们进行了MTRAPwestern blotting,与阴性对照组相比,MS2-AGPGMCP-3FLAG质粒的共表达导致PFKFB3显著富集,表明PFKFB3特异性地与AGPG结合(图3d)。免疫荧光共聚焦分析表明,AGPGPFKFB3主要在细胞核内共聚焦,在细胞质内有部分共聚焦,提示AGPG-PFKFB3复合物可能在细胞核和细胞质中都起作用(图3e)。此外,我们用qPCR检测AGPG的表达,用western blotting检测PFKFB3在一组ESCC细胞、12ESCC组织和匹配的正常食管组织(SYSUCC)中的表达。如所料,AGPG的表达与ESCCPFKFB3的表达呈正相关(图3f),这进一步揭示了AGPGPFKFB3之间的功能关系。总之,这些结果表明AGPGPFKFB3是密切相关的,它们的相互作用在人类癌症的发展中起着重要作用。

5 AGPG介导的T5片段与PFKFB3的相互作用

 

为了定位介导AGPGPFKFB3相互作用的区域,我们使用体外合成的全长(FLAGPGT11–800)、T2801–1140)、T31141–1700)、T41701–2030)和T52031–2321)片段进行RNA pull-down分析,然后通过western blotting分析产物。我们证明了T5片段可以与PFKFB3结合,而其他片段或珠状对照不能结合。用纯化的重组PFKFB3进一步验证了这些结果(图3g)。我们还进行了CLIP qPCR分析证明T5片段是负责结合PFKFB3的主要区域(图3h)。删除T5片段后,AGPG不能再与PFKFB3相互作用(图3i)。AGPG FL的过表达足以防止AGPG敲除后观察到的表型,包括糖酵解性重编程和细胞增殖(图3jk)。这些结果显示,AGPGPFKFB3相互作用和调节需要T5片段,而下游细胞过程可能是通过AGPGPFKFB3相互作用介导的。为了进一步确定与PFKFB3结合的特定基序,我们进行了HITS-CLIP,在这些基序中,CCAGCCA或类似的基序是高度排序的,可以通过多种方法识别。这些数据表明AGPGCCAGCCA基序对其结合PFKFB3和促进肿瘤糖酵解重编程的能力很重要。

 

6 AGPG阻断APC/C介导的PFKFB3泛素化

 

由于PFKFB3含有一个激酶结构域和一个磷酸酶结构域,因此构建了三个含有FL1-520)、N-末端(N1-245)和C-末端(C 246-520)结构的带有人类标记的PFKFB3载体,以鉴定与AGPG相关的PFKFB3残基。有趣的是,我们证明AGPG主要与C-末端片段相互作用,与N-末端片段的结合zui小(图4a)。然后,我们使用IgG对照进行RIP分析。如所料,AGPGPFKFB3C末端片段一起沉淀(图4b)。然后,我们评估了AGPG-PFKFB3相互作用对PFKFB3的功能影响。有趣的是,shRNA介导的AGPG基因敲除显著降低了PFKFB3的表达(图4c),这也被CRISPR/Cas9证实在AGPG-CRISPR-KO细胞中(图4d)。此外,过表达AGPG FL互补了AGPG缺失引起的PFKFB3shui平下降(图4d)。这些数据表明AGPG可能通过T5片段调节PFKFB3蛋白shui平。并且蛋白酶体抑制剂MG-132恢复了PFKFB3shui平的降低(图4e)。PFKFB3包含一个KEN盒,通过后期靶向蛋白质泛素化测试,PFKFB3被证明受到涉及一种细胞周期调节的E3泛素连接酶APC/C-Cdh1的降解。因此,为了进一步阐明AGPG阻断PFKFB3泛素化的机制,我们使用PFKFB3Cdc27抗体进行coIP分析,以确定AGPG是否影响PFKFB3和活性APC/C之间的相互作用。结果显示AGPG CRISPR KO显著增加了PFKFB3/Cdc27的相互作用(图4h),提示AGPG可阻断Cdc27PFKFB3的结合。

7 AGPGp53的转录靶点

 

由于AGPG在肿瘤中高表达,我们试图确定AGPG的调节机制。通路分析表明AGPG表达与p53呈负相关(图5a)。对不同TP53基因型的细胞的分析表明TP53 KOHCT-116细胞的AGPGshui平高于对照细胞(图5b),具有WT-TP53KYSE150)的细胞表达的AGPGshui平远低于含有突变株(MTTP53TE-1KYSE3024的细胞(图5c)。KYSE150HCT-116细胞中WT TP53的过度表达降低了AGPGshui平,而TP53的敲除增加了AGPG的表达,进一步证实了p53在调节AGPG表达中的作用(图5d)。此外,通过qPCR分析,AGPG表达shui平与WT-TP53ESCC患者的TP53表达呈负相关(图5eSYSUCCn = 72)。接下来,我们确定了p53介导的AGPG调控所需的区域,AGPG启动子包含p53结合序列(图5f),该序列被识别为p53结合区(p53-BR)(图5g)。且含有完整p53-BRp53-BR-wt)的荧光素酶报告子的转录活性明显弱于那些p53-BR缺失的报告子(p53-BR-mt)。此外,WT-TP53的共转染选择性地降低了具有完整p53-BR的报告者的转录活性(图5h)。总之,我们的数据显示p53AGPG转录中的重要调节作用,TP53的丢失或突变导致AGPG的显著上调。包括缺氧、DNA损伤和癌基因表达等多个微环境因素下,我们研究了其参与的AGPG调控网络(图5i)。在293 T细胞中,癌基因KRasG12V的表达导致AGPG上调和TP53下调(图5j),表明癌基因应激通过影响TP53状态参与AGPG调控。我们还将我们的分析扩展到缺氧条件下,通过检测暴露于严重缺氧或正常缺氧48小时的细胞中AGPGTP53的表达。WTMT p53均如先前报道的那样上调;缺氧后,TP53细胞(KYSE150)中AGPG的表达降低,TP53细胞(TE-1KYSE30)中AGPG的表达显著增加(图5k)。这些结果表明,在WT-TP53存在下,缺氧诱导的AGPG上调可以被抑制。

8 AGPGESCC肿瘤生长的影响

 

然后,我们探讨了AGPG在体内肿瘤发生中的作用。AGPG基因敲除显著抑制了基于细胞的异种移植瘤生长(图6a-c)。如血黄素和曙红(HE)和免疫组化(IHC)结果所示,AGPG基因敲除降低了细胞增殖标记Ki67shui平,降低了PFKFB3CDK1shui平,但增加了p27shui平(图6de);这些结果与我们的体外实验结果一致,在患者来源的异种移植(PDX)模型(使用来自两个ESCC患者的肿瘤组织生成,SYSUCC)(图6f)中,通过体内优化的AGPG抑制剂消耗AGPG显著降低肿瘤生长(图6g-i),表明AGPG是一个有前途的治疗靶点。PDX模型中使用的体内优化AGPG抑制剂的主要成分是反义寡核苷酸,它对核定位RNAs28具有较强的敲除作用。因此,如HEIHC分析所示,AGPG基因敲除显著影响细胞增殖(Ki67所示),这可能归因于前面提到的PFKFB3和下游CDK1p27表达的调节

9 p53-AGPG-PFKFB3轴参与ESCC的形成

 

为了确定p53-AGPG-PFKFB3是否与ESCC的发生有临床关联和病理关系,我们通过qPCRKi67检测了AGPG的表达,通过IHC检测了PFKFB3CDK1p27p53的表达。AGPG高组Ki67PFKFB3CDK1表达较高,p27p53表达较低,而AGPG低组则相反(图7ab)。总之,我们推测p53-AGPG-PFKFB3的失调促进了ESCC的发展。与之前的报道一致,PFKFB3在恶性组织中高表达(图7cd),并且PFKFB3高表达与ESCC患者的不良预后相关(图7e)。接下来我们通过RNAScope-ISH检测AGPG在这些组织中的表达。然后,将组织分为AGPG/PFKFB3高组、AGPG/PFKFB3中间组和AGPG/PFKFB3低组,其中AGPG/PFKFB3高组的预后比其他组差得多(图7f)。这些数据进一步表明AGPG/PFKFB3是一个有前途的预后指标和潜在的治疗靶点。

 

 

 

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