作者：花花是个学术张

花花相信大家对 IHC 一定不陌生，世界那么大，实验方法层出不穷，但是免疫组化却是经典

中的经典，想看看别的高大上的技术？不急，我们先来复习复习免疫组化。

免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry），是一项利用抗原抗体反应，通 

过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。

免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和

组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴

露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首xuan的标本制作方法。

好了，重点来了，下面是花花多年来总结的免疫组化步骤和经验，各位看官不要错过哦！

① 在 60°烤箱烤片 30~60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢

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固贴在玻片上。做切片是免疫组化的前提切片子zui好是找专业培训过的人员切片，片子的厚

薄均匀，切片的完整，无褶无刀痕。考研刀工的时候。

② 脱蜡水化，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各 10min，乙醇梯度（高至低）各 2min，水。然

后用自来水洗一下，但不要直接对着切片冲洗。

③ 抗原修复，小编用的是高压热修复，ph6.0 的柠檬酸盐缓冲液，一定要全部浸泡切片，

等高压锅冒气后 5min 结束，自然冷却，温度骤降可能引起脱片哦。3%H2O2 避光浸泡 15min

（当然有的朋友用 EDTA 修复或者说使用微波修复等方法也是可以的，但是每一种抗体对不 

同的抗原修复方法的反应是不一样的，得具体对待。）

④ 这一步有神器，用“组传”的免疫组化油笔围绕组织画圈，接下来就能看见它的功效了。

PBS 洗 5min x 3 次。PBS 会被锁在画的圈中，不会流干，保证不干片。

⑤ 滴加 5%BSA （BSA 用 PBS 溶）稀释的一抗，每个组织约 20ul，用 200ul 的枪头抹

平，4°过夜或者 37°1~2h，小编用的是第二种方法。（每种组织大小不一样，面积大概 1 乘 1

的可以 20ul 就够了，对于类似 NPC 的组织就没必要这么大了，关于一抗的问题，个人建议

4°过夜的方法，当然 37°1~2hour 也是可以的，两种方法没法说谁好谁不好，不同的抗体对

方法的敏感性是不一样的）再次 PBS 洗 5min x 3 次。

⑥ 滴加二抗，一滴每个，用 200ul 的枪头抹平，室温静置 30min。（本人用的是××公司

（此处坚决不植入广告）货号 GK500705 的二抗检测试剂盒，很好用，极力推荐。）

⑦ 再次 PBS 洗 5min x 3 次⑧ DAB- H2O2 显色 10min。（B：C=1:50，25ul 每个，现配现用），在这时要观察，如果染色

明显，不到 10 分钟即可蒸馏水洗终止显色，但是一般超过 20min 都不会有什么好结果。

⑨ Mayer 苏木素染色 30s，水洗，盐酸酒精分化 3s，流水浸 15min

⑩ 脱水,乙酸 2min，乙醇梯度（低至高）各 2min，二甲苯 5min

⑪ 中性树胶封片。

结果分析：

镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色

比如这样：

661 结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在 40*光镜下，随机

10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分

淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）和阳性范围（1 分 0-25%，2 分 26-50%，3 分 51-75%，4

分 76-100%）评分，zui终分数相加。

再来看下反面教材

zui常见的非特异性着色：

662还有背景过深的：

要避免成为上述的两种典型，做出一张可以见老板的结果，每步都要且做且思考。花花再啰

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嗦几句：

1 脱蜡和脱水的步骤呢，每个实验室都有自己独到的方法，用的乙醇的梯度不*相同，大

家按照自己的习惯那套来就好。但要注意，脱蜡和水化不全引起局灶性反应，会导致非特异

性着色。

2 一定要防止干片！干片也很容易引起非特异性着色。

3 在用枪头抹平抗体时，要尽量将枪头放平，用斜面而不要用尖头接触组织，这一步要轻柔

小心，可能你只是轻轻刮到几下，但镜下组织就变得乱七八糟的了（别问我是怎么知道的）

4 PBS 在洗的时候，不要对着组织冲洗，会脱片。小编的方法是将冲洗着力点放在玻片的边

缘，让液体自然流向组织。

5 一抗浓度至关重要，这直接影响了zui终的结果，摸条件时设置一抗浓度梯度。建议同时设

置一个阳性对照，可以排除一抗之外的操作问题。

6 背景染色过深的话，就要考虑一抗浓度过高或者一抗时间过长，显色时间过长这些问题了。 

7 降低组织非特异性染色，可以缩短一抗，二抗的时间，稀释抗体，也可以增加几次 PBS 冲

洗。或者直接用单抗。 免疫组化往往作为检测某蛋白在组织的表达情况出现在预实验中，免疫组化的结果可能

将直接影响课题的后续设计和进展。如果说我们的科研课题是一个大世界的话，免疫组化是

我们看向这个世界的敲门砖。

做好免疫组化

我们一起去更大的世界看看