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染色质免疫共沉淀(ChIP)

发布时间:2020-03-20浏览:288次

染色质免疫共沉淀(ChIP)

染色质免疫共沉淀可以:(1)组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”;(2)转录调控分

析;(3)药物开发研究;(4)DNA 损失与凋亡分析。

1 实验方法原理:

在保持组蛋白和 DNA 联合的同时,通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体,染色

质被切成很小的片断,并沉淀下来。

IP 是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到

免疫球蛋白的 FC 片段的现象活用开发出来的方法。

目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose 的 beads 上,使之与含有抗原的溶液

及抗体反应后,beads 上的 prorein A 就能吸附抗原达到精制的目的。

2 实验材料、试剂、仪器耗材:

细胞样品

甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、 Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶 K、omega 胶回收

试剂盒等

离心管、超声仪、电泳仪、离心机等

3 实验步骤:

一、细胞的甲醛交联与超声破碎( 第1天)

1. 取出 1 平皿细胞(10 cm 平皿),加入 243 ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为 1%(培

养基共有 9 ml)。

2. 37℃孵育 10 min。

3. 终止交联:加甘氨酸至终浓度为 0.125 M。450 ul 2.5 M 甘氨酸于平皿中。混匀后,在

室温下放置 5 min 即可。4. 吸尽培养基,用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 次。

5. 细胞刮刀收集细胞于 15 ml 离心管中(PBS 依次为 5 ml,3 ml 和 3 ml)。预冷后 2 000

rpm 5 min 收集细胞。

6. 倒去上清。按照细胞量,加入 SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每 200ul 含 2×106

个细胞。这样每 100 ul 溶液含 1×106 个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7

长满板为 5×106 个细胞。本次细胞长得约为 80%。即为 4×106 个细胞。因此每管加入 400

ul SDS Lysis Buffer。将 2 管混在一起,共 800 ul。

7. 超声破碎:VCX750,25%功率,4.5 s 冲击,9 s 间隙。共 14 次。

二、除杂及抗体哺育 ( 第1天)

1. 超声破碎结束后,10 000 g 4℃离心 10 min。去除不溶物质。

2. 留取 300ul 做实验,其余保存于-80℃。

3. 300 ul 中,100 ul 加抗体做为实验组;100 ul 不加抗体做为对照组;100 ul 加入 4 ul 5

M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2 M),65℃处理 3 h 解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。

4. 在 100 ul 的超声破碎产物中,加入 900 ul ChIP DilutionBuffer 和 20 ul 的 50×PIC。

再各加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀 1 h。

5. 1 h 后,在 4℃静置 10 min 沉淀,700 rpm 离心 1 min。

6. 取上清。各留取 20 ul 做为 input。一管中加入 1 ul 抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠

转过夜。

三、检验超声破碎的效果 ( 第1天)

1. 取 100 ul 超声破碎后产物,加入 4 ul 5M NaCl,65℃处理 2 h 解交联。

2. 分出一半用酚/氯fang抽提。电泳检测超声效果。

四、免疫复合物的沉淀及清洗( 第二天)1. 孵育过夜后,每管中加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃颠转 2 h。

2. 4℃静置 10 min 后,700 rpm 离心 1 min。除去上清。

3. 依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在 4℃颠转 10 min,4℃静

置 10 min 沉淀,700 rpm 离心 1 min,除去上清。

洗涤溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

4. 清洗完毕后,开始洗脱。

洗脱液的配方:100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共 1 ml。

每管加入 250 ul 洗脱 buffer,室温下颠转 15 min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一

次。最终的洗脱液为每管 500 ul。

5. 解交联:每管中加入 20 ul 5M NaCl(NaCl 终浓度为 0.2 M)。

6. 混匀,65℃解交联过夜。

五、DNA 样品的回收(第三天)

1. 解交联结束后,每管加入 1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育 1 h。

2. 每管加入 10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml 蛋白酶 K。

45℃处理 2 h。

3. DNA的片段的回收----omega 胶回收试剂盒。最终的样品溶于 100 ul ddH2O。

六、PCR 分析(第三天)ChIP-chip 技术对于大规模挖掘顺式调控信息成绩卓著,同时它可以用于胚胎干细胞和一些

疾病如癌症、心血管疾病和中央神经紊乱的发生的机制。研究人员还可以利用这项技术开发

一些治疗方法。目前 ChIP-chip 技术研究主要集中于两个领域:及转录因子的结合和条件

特异性;组蛋白的修饰,组蛋白修饰蛋白和染色体重建。

ChIP-chip 在描述转录结合因子动力学中的研究、染色体结构组分的分布、在组蛋白的修饰、

组蛋白修饰蛋白和染色体重建中的应用也十分广泛。ChIP-chip 技术的优点是,可以在体

内进行反应;在给定的检验细胞环境的模式下得到 DNA 相互关系的简单影像;使用特异性

修正抗体鉴定与包含有一个特异性后转录修正的蛋白质的相关位点;直接或者间接(通过蛋

白质与蛋白质的相互作用)的鉴别基因组与蛋白质的相关位点。缺点是:需要一个特异性蛋

白质抗体,有时难于获得;为了获得高丰度的结合片段,必须实验演示胞内条件下靶标蛋白

质的表达情况;调控蛋白质的基因的获取可能需要限制在组织来源中。

总之,ChIP-chip 技术的发展为析活细胞或组织中 DNA 与蛋白质的相互关系提供了一个极

为有力的工具。在未来的研究中,将对芯片的构建进行改进,提高其实用性。使用易于获得

抗体,增加这种方法的可用性。

在 PCR 分析这一块,比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量 PCR 的普及,

大家也越来越倾向于 Q-PCR 了。此外还有一些由 ChIP 衍生出来的方法。例如 RIP(其实

就是用 ChIP 的方法研究细胞内蛋白与 RNA 的相互结合,具体方法和 ChIP 差不多,只是实

验过程中要注意防止 RNase,最后分析的时候需要先将 RNA 逆转录成为 cDNA);还有

ChIP-chip(其实就是 ChIP 富集得到的 DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在 ChIP 的基础

上有所改变,不同的公司有不同的做法,要根据公司的要求来准备样品)。

4 注意事项:1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在 IP 反应。建

议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。

2. 注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲

液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分

抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶

解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使 IP 成功,

也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

3. 为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。

每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉

降在 beads 上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。

5 其他:

一、染色质免疫共沉淀简介

真核生物的基因组 DNA 以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下

的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin

immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯1研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的方法。

它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物,并将其随机切断为一定长度范

围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的

DNA的片段,通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。CHIP

不仅可以检测体内反式因子与 DNA 的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与

基因表达的关系。而且,CHIP 与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP 与基因芯片

相结合建立的 CHIP-on-chip 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;CHIP 与

体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-CHIP 用于研究 RNA 在基因表达调控中的作用。由此可见,随着 CHIP 的进一步完善,它必将会在基因表达调控研究中

发挥越来越重要的作用。

二、ChIP 的一般流程

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA 复合物相互

结合---加入 ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进

行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA 复合物---解交联,纯化

富集的 DNA-片断---PCR 分析。

 

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