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免疫共沉淀 Co-IP 实验操作步骤

发布时间:2020-03-19浏览:236次

免疫共沉淀 Co-IP 实验操作步骤

一、原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为ji

的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用

的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质

-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X,那么与 X 在体

内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose

的 beads 上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads 上的 prorein A 就能吸附抗原

达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一

种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白

的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态

的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质

相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作

用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不

正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

二、准备工作:

预冷 PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

1. 用预冷的 PBS 洗涤细胞两次,最后一次吸干 PBS;2. 加入预冷的 RIPA Buffer(1ml/107 个细胞、10cm 培养皿或 150cm2 培养瓶,

0.5ml/5×106 个细胞、6cm 培养皿、75cm2 培养瓶)

3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到 1.5EP 管中,4℃,

缓慢晃动 15min(EP 管插冰上,置水平摇床上)

4. 4℃,14000g 离心 15min,立即将上清转移到一个新的离心管中

5. 准备 Protein A agarose,用 PBS 洗两遍珠子,然后用 PBS 配制成 50%浓度,建

议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

6. 每 1ml 总蛋白中加入 100μl Protein A 琼脂糖珠(50%),4℃摇晃 10min(EP

管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g 离心 15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除 Protein A 珠

8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释 1:10 倍

以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)

9. 用 PBS 将总蛋白稀释到约 1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白

在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如 10 μg/μl)

10. 加入一定体积的兔抗到 500μl 总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞

系中的多少而异

11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2

h 室温孵育12. 加入 100μl Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混

合物过夜或室温 1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加 2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠 IgG,

兔抗鸡 IgG)

13. 14000rpm 瞬时离心 5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的

RIPA buffer 洗 3 遍,800μl/遍,RIPA buffer 有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内

部的结合,可以使用 PBS

14. 用 60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量

依据上样多少的需要而定(60 μl 足够上三道)

15. 将上样样品煮 5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余

琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮 5min 变性。

RIPA Buffer 配制:

ji础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用 H2O 配制成 10%储存液)

去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用 H2O 配制成 10%储存液;避光保存)

注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶

变性,导致活性丧失。

RIPA 蛋白酶抑制剂苯甲jihuang酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成 200mM 的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用 H2O 配制成 100mM 的储存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用 H2O 配制成 1mg/ml 的储存液,分装,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用 H2O 配制成 1mg/ml 的储存液,分装,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成 1mg/ml 的储存液,分装,-20℃保

存)

RIPA 磷酸(酯)酶抑制剂

激活的 Na3VO4(用 H2O 配制成 200mM 的储存液,见 Sodium Orthovanadate

Activation Protoco)

NaF(200mM 的储存液,室温保存)

 

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