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SDS-PAGE 蛋白质样品的制备

发布时间:2020-03-19浏览:246次

将收集的各样品加入等体积的 2×SDS-PAGE Loading Buffer,煮沸裂解 5min,冰浴

2min,12,000rpm 离心 10min,取上清-20℃保存备用。

SDS-PAGE 蛋白质电泳(参照分子克隆实验指南操作)(萨姆布鲁克,2002)

1)按照电泳装置的使用说明,装好洁净干燥的玻璃板。

2)分离胶的制备

按下列成分配制10mL 12%分离胶:

ddH2O

30%丙烯酰胺混合液

1.5M Tris(pH8.8)

10%SDS

10%过硫酸铵

TEMED

3.3 mL

4.0 mL

2.5 mL

0.1 mL

0.1 mL

0.004 mL

总体积

10 mL

各成分加入后迅速旋涡混匀,用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中,

并为积层胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层水封顶,以防止空气中的氧对凝胶聚合的

抑制作用。凝胶聚合完成后,倒掉覆盖的水层,用水清洗凝胶顶部数次,用滤纸吸干凝胶顶

端的水。

3)积层胶的制备

按下列成分配制2mL 5%的积层胶:

ddH2O

30%丙烯酰胺混合液

1.4mL

0.33mL1.0M Tris(pH6.8)

10%SDS

10%过硫酸铵

TEMED

0.25mL

0.02mL

0.02mL

0.002mL

总体积

2mL

各成分加入后迅速旋涡混匀,用微量移液器将其灌注到分离胶上,灌满后小心插入加样

梳,尽可能避免产生气泡。

4)待积层胶凝固后,小心拔下梳子。

5)将凝胶固定于电泳装置上,加入足量的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液,在加样孔中分

别加入20μL各样品。

6)样品在积层胶中电泳时,使用80V电压,待溴酚蓝带进入分离胶后,将电压升至

120V,继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且开始泳出胶底面,关闭电源。

7)卸下凝胶,将其浸泡在至少5倍体积的考马斯亮蓝R-250染色液中,置水平摇床上

室温染色至少4h,之后取出染色的凝胶并回收染液,以备再用,将凝胶浸泡于考马斯亮蓝

脱色液中,在水平摇床上脱色4~8h,其间更换脱色液3~4次,直至凝胶脱色到条带清晰为

止,观察记录结果并拍照。

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