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ELISA 步骤、试剂及注意事项

发布时间:2020-03-18浏览:190次

操作步骤

方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

1. 包被:用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1~10μg/

ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲

液洗 3 次,每次 3 分钟。(简称洗涤,下同)。

2. 加样:加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中,置 37℃孵育 1 小

时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。

37℃孵育 0.5~1 小时,洗涤。

4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml,37℃10~30

分钟。

5. 终止反应:于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。

6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度

越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测 O·D

值:在 ELISA 检测仪上,于 450nm(若以 ABTS 显色,则 410nm)处,以空白对照孔调零后

测各孔 O·D 值,若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍,即为阳性。

方法二 用于检测未知抗体的间接法:

用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1~10μg/ml,每孔加 0.1ml,4℃过夜。次日洗涤 3

次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml 于上述已包被之反应孔中,置 37℃孵育 1 小时,

洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育 30-60 分钟,洗涤,最后一遍用 DDW 洗涤。其余步骤同“双抗体夹心

法”的 4、5、6。

试剂器材

1. 试剂

(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M 碳酸盐缓冲液):NaCO3?1.59 克 NaHCO3 2.93 克

加蒸馏水至 1000ml

(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS):0.15M KH2PO4 0.2 克 Na2HPO4·12H2O 2.9 克

NaCl 8.0 克 KCl 0.2 克 Tween-20 0.05% 0.5ml 加蒸馏水至 1000ml

(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1 克 加洗涤缓冲液至 100ml 或以羊血清、兔血

清等 血清与洗涤液配成 5~10%使用。

(4) 终止液(2M H2SO4):蒸馏水 178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml。

(5) 底物缓冲液(PH5.0 磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4 克/L) 25.7ml 0.1M

柠檬酸(19.2 克/L) 24.3ml 加蒸馏水 50ml。

(6)TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml 无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5)

10ml0.75%H2O2 32μl

(7) ABTS 使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3%H2O2 2μl

(8)抗原、抗体和酶标记抗体。

(9) 正常人血清和阳性对照血清。

2. 器材:

(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40 孔或 96 孔,ELISA 检测仪,50μl 及 100μl 加样

器,塑料滴头,小毛巾,洗涤瓶。 (2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

(3) 4℃冰箱,37℃孵育箱。

注意事项

1. 正式试验时,应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件,待检样品应作一式二份,

以保证实验结果的准确性。有时本底较高,说明有非特异性反应,可采用羊血清、兔血清或

BSA 等封闭。

2. 在 ELISA 中,进行各项实验条件的选择是很重要的,其中包括:

(1) 固相载体的选择:许多物质可作为固相载体,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺

和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。

不管何种载体,在使用前均可进行筛选:用等量抗原包被,在同一实验条件下进行反应,观

察其显色反应是否均一性,据此判明其吸附性能是否良好。

(2) 包被抗体(或抗原)的选择:将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,

吸附时一般要求 PH 在 9.0~9.6 之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采

用 4℃18~24 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0

和 10μg/ml 等)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的 OD 值。选择 OD

值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为 1~10μg/ml。

(3) 酶标记抗体工作浓度的选择:首先用直接 ELISA 法进行初步效价的滴定(见酶标记

抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗

体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

(4) 酶的底物及供氢体的选择:对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反

应,而本身无色。有些供氢体(如 OPD 等)有潜在的致癌作用,应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体,如 TMB 和 ABTS 是目前较为满意的供氢体。底物作用一段

时间后,应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间,以 10-30 分钟为宜。底物使

用液必须新鲜配制,尤其是 H2O2 在临用前加入。

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