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细胞增殖检测:MTT 法

发布时间:2020-03-16浏览:479次

MTT 分析法以活细胞代谢物还原剂 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di

phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑蓝为基础。MTT 为黄色化合物,是一种接受氢离

子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C 的作用下

tetrazolium 环开裂,生成蓝色的 formazan 结晶,formazan 结晶的生成量仅与活细胞数

目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将 MTT 还原)。还原生成的 formazan 结晶

可在含 50%的 N,N-二甲基甲酰胺和 20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的 MTT 溶解液中

溶解,利用酶标仪测定 490 nm 处的光密度 OD 值,以反映出活细胞数目。也可以用 DMSO

来溶解。

MTT 粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台

上的日光灯来避光,觉得这样比较好。

一、步骤

1、接种细胞

用含 10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔 1000-10000 个细胞接种到 96

孔板,每孔体积 200ul。

2、培养细胞

同一般培养条件,培养 3-5 天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3、呈色

培养 3-5 天后,每孔加 MTT 溶液(5mg/ml 用 PBS 配)20ul.继续孵育 4 小时,终止培

养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加

150ul DMSO,振荡 10 分钟,使结晶物充分融解。

4、比色选择 490nm 波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,

吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

二、注意事项

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰:一般选小于 10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内

残余培养液。

3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,zui

后比色以空白调零。

MTT 实验吸光度zui后要在 0-0.7 之间,超出这个范围就不是直线关系,

IC50 是半抑制率,意思是抑制率 50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后

计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到 50%抑制率

时候的药品浓度,就是 IC50。要点:药品 2 倍稀释,多做梯度,做点线图即可!

三、举例

各组浓度 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为 10,zui大浓度为

0.1,抑制率为 0.95、0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入计算公式:

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025有一个公式可供参考;

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg zui大剂量

I:lg(zui大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:zui大阳性反应率

Pn:zui小阳性反应率

抑制率=1-加药组 OD 值/对照组 OD 值

公式中的zui大zui小阳性反应率就是zui大zui小抑制率

例:

用 96 孔板培养 SMMC-7721 肝癌做 MTT 测细胞活力,应该加多少 1640 培养基,多少

MTT 和 DMSO 合适?根据书上说的加 200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加 DMSO 之

前要尽量去掉培养液,便于 DMSO 溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔 4000 个细胞为宜,既细胞浓度在 20000 个/ml,MTT 加 20ul,作用四小时后洗

掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加 150ul DMSO,在脱色摇床上振荡 10 分钟,

然后测吸光值。

一般要低于 IC50,避免非调亡性杀伤的细胞太多,造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般

用 1/2-1/3 的 IC50,作用时间为 36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于 1%,用

药后一般为 5-10%(Annexin V),细胞周期的亚 G0 峰比较明显。

MTT 法心得MTT 实验是检测细胞活力的实验方法,由于细胞活力与细胞数呈正相关,因此也常常用来

检测细胞的增殖情况。

一、MTT 的原理

活细胞有琥珀酸脱氢酶,将 MTT 还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多,笔者

将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。

二、MTT 法检测细胞增殖实验的注意事项

1、培养好细胞点板

养细胞没啥好说的,如果不知道细胞如何养,那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的

名字,就可以上 检索细胞的培养信息,这个网站上的培养方法是标准培养方

法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐,点板时的细胞浓度是zui难

掌握的,这一点笔者的心得如下:

自己先将细胞养一段时间,大概了解细胞的增殖情况,在 MTT 检测时实际上要求细胞大概

能长满 96-孔板的 80-90%,如果打算养 48 小时就检测,根据细胞的生长情况反推点板时

的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数,将消化好的细胞混匀后(可能是 10ml)直

接在一个废弃(进行过无菌处理)的 96 孔板中依次加入 180、100、50 微升细胞,将

细胞放置几分钟就会沉到板底了,这时在显微镜下观察,推测哪个孔的细胞 48 h 能基本长

满板底,假设 50 微升的孔比较合适,而点板时没孔需点 200 微升,那么就将细胞浓度再

稀释 4 倍就可以正式点板了,这时顺便将细胞进行计数(因为实验记录要求写啊)。这样

就 OK 了!如果细胞还太多,将细胞稀释 4 倍后再重复以上操作。注意:不要过分信赖细胞

计数,因为细胞计数的取样量为 20 微升左右,由于颗粒的分布不均匀,代表性是很差的。

建议:细胞计数一定要会,但不要完全依赖它。点板时一定要将细胞消化成单个细胞,而且一定要混匀,用排枪,否则,MTT 的 SD

会狂大!

2、点板布局

其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养 48 h 或更长,建议不要吝啬 96-孔板的四

周边孔,这 32 个边孔不能使用,建议加入灭菌 PBS 以饱和中间 64 个孔的水分。因为细胞

培养过程中,边孔的水分蒸发很快,培养液及里面的药物会出现浓缩现象,细胞的状况就复

杂了,有些人称之为%26ldquo;边缘效应%26rdquo;这些孔的 SD 也会狂大,既然如此,

不如不用。

3、加 MTT

如果确认你考察的药物没有氧化还原性,你可以直接加入 MTT 溶液(总体积的 1/10),

如果你没有把握,建议在加 MTT 前换一次液;如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强,

比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建议你用 PBS 将细胞洗洗,否则这些药物会将 MTT 还原

成棕褐色沉淀,这种效果可能是你不需要的。

4、加入 MTT 后的反应

时间为 3-4h,此时弃去各孔中的液体在加入 200 微升的 DMSO。为了将沉淀溶解完全,

尽可能将水弃除干净,加入 DMSO 后在摇床上震摇 10min。提醒:如果你的细胞贴壁不好,

此时的沉淀在弃去液体时易丢失,因此贴壁不好的细胞在点板时记得将 96 孔板用多聚赖氨

酸处理处理,要么在弃液体时先用甩板机离心,再轻轻弃去液体。关于 DMSO 的量,每孔

的体积有点儿差异不干扰检测,只要能将沉淀完全溶解就行了。至于 DMSO 的体积差异不

同为什么不影响检测值已经被数学证明了,在此我不多说,如果有人不明白我再证明给他看。

当然为了养成良好的实验习惯,DMSO 的体积还是一致的好。

5、检测 MTT还原的 MTT 在 460-630 均有较好的吸收,如果你的酶标仪是滤光片,可以选 470 nm 左

右或 630 nm 左右的滤光片,如果酶标仪有单波长,你可以在检测前扫描一下吸收谱,选

用zui大细说波长检测就是了,zui大波长,大概在 550nm 附近,必要时加一个参比波长以扣

除非特异性吸收。

6、吸收值分析

在理想的 MTT 实验中,如果是细胞抑制实验,不加药物处理组的吸收值应该在 0.8-1.2 左

右,太小检测误差占的比例较多,太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比

尔定律中有解释。

7、建议

如果你觉得 MTT 中出现的问题不好解决,那么建议你做 CCK-8 实验,原理与 MTT 相似,

但操作上简化些,当然,费用也稍微高一些。

 

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