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细胞凋亡检测实验(Annexin V/PI 双染色法)

发布时间:2020-03-16浏览:566次

细胞凋亡检测可以:(1)用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究;(2)应用

于临床诊疗,新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治

疗;(3)对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。

1、实验方法和原理

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一

是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一

种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂

分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。

Annexin V 是一种 Ca+依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血

管蛋白,Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性。对 PS 有高度的亲和性。因此,

该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。

PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差

别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

因此,可以建立一种用 Annexin V 结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除

试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。

2、实验材料、试剂、仪器和耗材

细胞;

HEPES 缓冲液、NaCl、CaCl2、PI、ANNEXIN V-FITC 试剂盒;

流式细胞仪。3、实验步骤

一、试剂与仪器

1. 孵育缓冲液:10 mmol/L HEPES/NaOH,pH7.4,140 mmol/L NaCl,5 mmol/L CaCl2。

2. 标记液:将 FITC- Annexin V(宝灵曼公司产品)和 PI 加入到孵育缓冲液中,终浓度均

为 1 ug/ml。

3. 流式细胞仪。

二、实验步骤

1. 细胞收集:悬浮细胞直接收集到 10 ml 的离心管中,每样本细胞数为(1~5)×106/mL

500~1 000 r/min 离心 5 min,弃去培养液。

2. 用孵育缓冲液洗涤 1 次,500~1 000 r/min 离心 5 min。

3. 用 100 ul 的标记溶液重悬细胞,室温下避光孵育 10~15 min。

4. 500~1 000 r/min 离心 5 min 沉淀细胞孵育缓冲液洗 1 次。

5. 加入荧光(SA-FLOUS)溶液 4℃下孵育 20 min,避光并不时振动。

6. 流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用 488 nm,用一波长为 515 nm 的通带滤器

检测 FITC 荧光,另一波长大于 560 nm 的滤器检测 PI。

7. 结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如 PI 有抗染性,坏死细胞则不能。

细胞膜有损伤的细胞的 DNA 可被 PI 着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会

有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期 PI 不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞

与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右

上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。

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