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Caco-2 细胞转运模型一点小事

发布时间:2020-03-11浏览:183次

                                 想研究药物口服吸收?Caco-2 细胞模型来

作者:叶军 

Caco-2 细胞转运模型是被国外制药企业以及实验室应用的模拟肠道吸收的药物筛选模 型,已广泛应用于药物在小肠吸收的评价和转运机制研究中。Caco-2 细胞的结构和功能类似 于人小肠上皮细胞,含有与小肠刷状边缘上皮相关的酶系。 

与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现的逆向分化不同,Caco-2 细胞在多孔可渗 透的聚碳酸酯膜上培养 3 周后可以自发分化为肠上皮细胞,形成致密的细胞单层,进而可用 作肠道转运模型(图 1)。 Caco-2 细胞模型培养和验证方法简单,与体内动物实验相比更为 方便、经济。 

 

1. Caco-2 细胞培养 

1) 采用 MEM 完全培养液(含 10%胎牛血清、1%非必须氨基酸、1%丙酮酸钠、1%谷氨酰胺 和 1%青-链霉素)在 37℃和 5% CO2 条件下培养 Caco-2 细胞; 

2) 每隔一天更换一次培养液。当细胞汇合程度达 80%时,进行细胞传代。将细胞培养液吸

出,用不含 Ca 2+和 Mg2+离子的 HBSS 小心清洗 2 次,加入 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 混

合消化液进行消化; 

3) 取细胞适量接种到 75 cm

2 培养瓶继续培养或进行铺板操作。 

2. Caco-2 细胞模型的构建及验证 

1) 收集对数期的 Caco-2 细胞,用 MEM 完全培养液将细胞浓度调整为 2.0×10

5 cells/mL; 

2) 在 Transwell 板(聚碳酸酯膜,0.4 µm,1.12 cm 2)(图 2)的基底侧(Basolateral side)加

入 1.5 mLMEM 完全培养液,在顶侧(Apical side)加入细胞悬液 0.5 mL; 

3) 放入细胞培养箱内培养,每两天换一次培养液,培养一周后每日换液; 

4) 继续培养至 21 天; 

5) 采用 Millicell ERS 电阻仪(Millipore 公司)测定跨上皮细胞电阻(大于 500 Ω•cm 2), 确定

细胞单层的致密性和完整性。 

3. 转运研究 

下面以荧光标记的药物为例,借助激光共聚焦显微镜来观察药物跨膜转运(图 3)。 

1) 取出 Transwell 板进行电阻测定,选择符合转运条件的细胞孔(电阻大于 500 Ω•cm 2)。 用

预热(37℃)的 Hank’s 缓冲液洗 2~3 遍,并置 37℃孵育平衡 20~30 min,吸弃洗液; 

2) 分别取 0.5 mL 荧光标记的药物溶液加入顶侧(Apical side)作为供给液,同时基底侧 (Basolateral side)加入 1.5 mL 空白 Hank’s 缓冲液作为接收液; 

3) 37℃条件下转运 2 h; 

4) 转运结束后移除孔内荧光液,加 HBSS 小心清洗 3 次,洗去未进入细胞的荧光染料结束转 运;孔内加适量 4%多聚甲醛溶液,室温下固定 20 min; 

5) 固定完成后用 HBSS 清洗 3 次,加 10 μg/mL Hoechst 33258 适量,室温下染核 1 h;HBSS 清洗 3 次后,加 2 滴抗荧光淬灭剂,小心将单层细胞剪下至玻底小皿中,在激光共聚焦显微 镜下进行 Z 轴横切,观察荧光标记药物的跨膜过程。 

由激光共聚焦显微镜拍摄的图可以看出,带绿色荧光的药物A与带红色荧光的药物B在Caco2 细胞模型中的跨膜转运速率不同,其中药物 A 的跨膜转运速率慢于药物 B,跨膜转运速率 的不同与药物本身的理化性质密切相关。 

除采用荧光标记的药物进行跨膜转运研究外,还可以采用非荧光标记的药物进行跨膜研究,

此时测定药物的跨膜转运能力就需要借助其他检测方式来(如高效液相色谱)完成。 

 

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