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变性梯度凝胶电泳

发布时间:2020-03-10浏览:121次

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种根据 DNA 的片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核

酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。核酸 50%发生变性时的温度称为熔

解温度(Tm)。Tm 值主要取决于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 将凝胶设置在双重

变性条件下:温度 50~60 ℃,变性剂 0~100%。当一双链 DNA 的片段通过一变性剂浓度呈

梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段 DNA 的低熔点区的

Tm 值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。这种局部解链的 DNA 分子迁移率发生改

变,达到分离的效果。Tm 的改变依赖于 DNA 序列,即使一个碱基的替代就可引起 Tm 值

的升高和降低。因此,DGGE 可以检测 DNA 分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以

及少于 10 个碱基的缺失突变。

详细

实验方法

变性梯度凝胶电泳(DGGE)

实验材料

DNA 样品

试剂、试剂盒

尿素

去离子甲酰胺

丙烯酰胺

甲叉双丙烯酰胺

琼脂糖

仪器、耗材PCR 扩增仪

变性梯度凝胶电泳仪

凝胶成像及分析系统

紫外透射仪

高速离心机

电泳仪

电泳槽

微量加样器

Tip 头

Tip 头盒

Eppendorf 管

Eppendorf 管架

一、实验原理

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种根据 DNA 的片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核

酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。核酸 50%发生变性时的温度称为熔

解温度(Tm)。Tm 值主要取决于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 将凝胶设置在双重

变性条件下:温度 50~60 ℃,变性剂 0~100%。当一双链 DNA 的片段通过一变性剂浓度呈

梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段 DNA 的低熔点区的

Tm 值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。这种局部解链的 DNA 分子迁移率发生改

变,达到分离的效果。Tm 的改变依赖于 DNA 序列,即使一个碱基的替代就可引起 Tm 值

的升高和降低。因此,DGGE 可以检测 DNA 分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以

及少于 10 个碱基的缺失突变。为了提高 DGGE 的突变检出率,可以人为地加入一个高熔点区——GC 夹。GC 夹(GC

clamp)就是在一侧引物的 5′端加上一个 30~40bp 的 GC 结构,这样在 PCR 产物的一侧

可产生一个高熔点区,使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此,DGGE 的突

变检出率可提高到接近于 100%。

作为一种突变检测技术,DGGE 具有如下的优点:(1)突变检出率高。DGGE 的突变检出

率为 99%以上。(2)检测片段长度可达 1kb,尤其适用于 100~500bp 的片段。(3)非

同位素性。DGGE 不需同位素掺入,可避免同位素污染及对人体造成的伤害。(4)操作简

便、快速。DGGE 一般在 24 小时内即可获得结果。(5)重复性好。但是,该方法需要特

殊的仪器,而且合成带 GC 夹的引物也比较昂贵。

二、实验用品

1.PCR 扩增仪;变性梯度凝胶电泳仪;凝胶成像及分析系统;紫外透射仪;高速离心机;

电泳仪;电泳槽。

2.尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖

3.微量加样器(200μl,20μl);Tip 头(200μl,20μl)。Tip 头盒(200μl,20μl);

Eppendorf 管(0.5ml,0.2ml),Eppendorf 管架。

4.PCR 扩增相关试剂

三、实验步骤

1.PCR 反应(同前)

其中,上游引物加 40bp [GC] Clamp。

2.PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳确认。

3.垂直变性梯度凝胶电泳变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为 6%聚丙烯酰胺凝胶,变性浓度为 0~

100%。其中,含 7 M 尿素和 40%去离子甲酰胺的胶为 100%变性,不含尿素和去离子甲

酰胺的胶为 0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件(即变性浓

度)。

PCR 产物加上样缓冲液后上样,300~400μl/孔,电压 150V,温度 60℃,时间 2~4 小时。

4.平行变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓

度,制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶,检测各标本是否存在突变。

PCR 产物加上样缓冲液后,25μl~30μl/孔,电压 150V,温度 60℃,时间 3~6 小时。

5.染色 5 分钟,凝胶成像仪分析结果。

四、注意事项

1、该实验中提取 DNA,以及 DGGE 操作中接触到得很多药品都有毒,还有致癌、变性等

毒害,一定要严格操作,做好防护保护自己。

 

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