变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据 DNA 的片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核

酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸 50%发生变性时的温度称为熔

解温度（Tm）。Tm 值主要取决于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 将凝胶设置在双重

变性条件下：温度 50~60 ℃，变性剂 0~100%。当一双链 DNA 的片段通过一变性剂浓度呈

梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段 DNA 的低熔点区的

Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的 DNA 分子迁移率发生改

变，达到分离的效果。Tm 的改变依赖于 DNA 序列，即使一个碱基的替代就可引起 Tm 值

的升高和降低。因此，DGGE 可以检测 DNA 分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以

及少于 10 个碱基的缺失突变。

详细

实验方法

• 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

实验材料

• DNA 样品

试剂、试剂盒

• 尿素

• 去离子甲酰胺

• 丙烯酰胺

• 甲叉双丙烯酰胺

• 琼脂糖

仪器、耗材• PCR 扩增仪

• 变性梯度凝胶电泳仪

• 凝胶成像及分析系统

• 紫外透射仪

• 高速离心机

• 电泳仪

• 电泳槽

• 微量加样器

• Tip 头

• Tip 头盒

• Eppendorf 管

• Eppendorf 管架

一、实验原理

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据 DNA 的片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核

酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。核酸 50%发生变性时的温度称为熔

解温度（Tm）。Tm 值主要取决于 DNA 分子中 GC 含量的多少。DGGE 将凝胶设置在双重

变性条件下：温度 50~60 ℃，变性剂 0~100%。当一双链 DNA 的片段通过一变性剂浓度呈

梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段 DNA 的低熔点区的

Tm 值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。这种局部解链的 DNA 分子迁移率发生改

变，达到分离的效果。Tm 的改变依赖于 DNA 序列，即使一个碱基的替代就可引起 Tm 值

的升高和降低。因此，DGGE 可以检测 DNA 分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以

及少于 10 个碱基的缺失突变。为了提高 DGGE 的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC 夹。GC 夹（GC

clamp）就是在一侧引物的 5′端加上一个 30~40bp 的 GC 结构，这样在 PCR 产物的一侧

可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE 的突

变检出率可提高到接近于 100%。

作为一种突变检测技术，DGGE 具有如下的优点：（1）突变检出率高。DGGE 的突变检出

率为 99%以上。（2）检测片段长度可达 1kb，尤其适用于 100~500bp 的片段。（3）非

同位素性。DGGE 不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。（4）操作简

便、快速。DGGE 一般在 24 小时内即可获得结果。（5）重复性好。但是，该方法需要特

殊的仪器，而且合成带 GC 夹的引物也比较昂贵。

二、实验用品

1．PCR 扩增仪；变性梯度凝胶电泳仪；凝胶成像及分析系统；紫外透射仪；高速离心机；

电泳仪；电泳槽。

2．尿素、去离子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、琼脂糖

3．微量加样器（200μl，20μl）；Tip 头（200μl，20μl）。Tip 头盒（200μl，20μl）；

Eppendorf 管（0.5ml，0.2ml），Eppendorf 管架。

4．PCR 扩增相关试剂

三、实验步骤

1．PCR 反应（同前）

其中，上游引物加 40bp [GC] Clamp。

2．PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳确认。

3．垂直变性梯度凝胶电泳变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为 6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为 0～

100%。其中，含 7 M 尿素和 40%去离子甲酰胺的胶为 100%变性，不含尿素和去离子甲

酰胺的胶为 0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的适解链条件（即变性浓

度）。

PCR 产物加上样缓冲液后上样，300～400μl/孔，电压 150V，温度 60℃，时间 2～4 小时。

4．平行变性梯度凝胶电泳

变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓

度，制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶，检测各标本是否存在突变。

PCR 产物加上样缓冲液后，25μl～30μl/孔，电压 150V，温度 60℃，时间 3～6 小时。

5．染色 5 分钟，凝胶成像仪分析结果。

四、注意事项

1、该实验中提取 DNA，以及 DGGE 操作中接触到得很多药品都有毒，还有致癌、变性等

毒害，一定要严格操作，做好防护保护自己。