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原位杂交实验

发布时间:2020-03-06浏览:706次

原位杂交实验

1 探针的设计与合成

1) 根据实验室已有的p8 基因cDNA全长序列,用premier primer5.0设计引物p81

p82,以卤虫 cDNA 为模板,PCR 扩增得到 346bp 的产物,用 Takara 胶回收试剂盒

回收纯化。

引物编号 引物序列 长度

p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp

p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp

2) 目的片段克隆

a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分,载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8,根据凝

胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下:

目的PCR片段                    5 μl

pGM-T载体(约50ng/uL         1 μl

10×T4 DNA Ligation Buffer         1 μl

T4 DNA Ligase3U/uL           1 μl

无菌去离子水                     3 μl

总体积                           10 μl

b. 轻轻弹动离心管以混合内容物,短暂离心。置于 PCR 仪中 16℃过夜连接,反应结束后

将离心管置于冰上。

c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μlIPTG 50mg/ml)、40 μlX-gal

20mg/ml),使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开,避光置于 37℃培养箱 1-3 小时,

使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。

d. 10 μl的连接产物加到100 μl DH5感受态细胞中,轻弹混匀,冰浴半小时,将离心

管置于 42℃水浴 90 秒,取出管后立即置于冰浴上放置 2-3 分钟,其间不要摇动离心管。

向离心管加入500 μl 37℃预热的LB(不含抗生素)培养基,150rpm摇床37℃振荡培养

45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。将菌液于4000g下离心

10分钟,去掉上清,加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上,用无菌

的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后,倒置平板,37℃培养12-16小时。

 

e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测,筛选转化子。

f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时,吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行

序列测序。

3) 重组质粒的线性化

6 μl以测序的重组质粒,选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl

质粒            6 μl

10xK Buffer      2 μl

NcoI          1 μl

0.1% BSA        2 μl

灭菌水          9 μl

终体积          20 μl

取酶切前后的质粒各 4 μl,经 1%琼脂糖电泳检测,确认酶切完全,将酶切产物用 Takara

胶回收试剂盒回收纯化,作为探针合成的模板。

4) 探针合成

按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南,标记反义RNA探针。

使用的所有试剂和器皿均经去 RNase 处理,合成方法如下:先准备反应体系。冰上向

RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:

纯化的线形质粒              1 μg

Rnase-free dH2O                   up to 13 μl

10xNTP labeling mixture        2 μl

10xTranscription buffer         2 μl

Rnase inhibitor                1 μl

SP6 RNA Polymerase           2 μl

总体积                          20 μl

稍混匀,短暂离心将反应液集于管底,37 2 h。反应结束后再补加2 μl DNase I37 15

min,反应结束后加入0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取3-5 μl 反应产物1%琼脂糖凝胶电泳

检测。-20℃保存备用。

2. 石蜡切片的制备

◆本实验在杂交结束前均必须保证 RNase-free.玻璃器皿采用 180℃烘烤 10 小时。其它采

DEPC处理,高温灭菌锅高温降解DEPC。若仪器不能高温处理,可用3%H2O2处理

半小时以上,DEPC水冲洗干净,烘干。

1) 组织的固定与包埋

选取不同发育时期(0h5h10h15h20h40h3d5d7d)的卤虫,经 DEPC

处理水冲洗表面盐分后,加入新鲜配制的4%多聚甲醛,于4℃固定5-8 h,再分别按下列

顺序进行脱水、透明和包埋: 30%乙醇脱水1 h50%乙醇脱水1 h70%乙醇脱水1 h80%

乙醇脱水乙醇脱水1 h90%乙醇脱水1 h,无水乙醇脱水1 h,无水乙醇脱水1 h,无水乙

:二甲苯(1:l)透明10 min,二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蜡(1:1)浸蜡30 min54

石蜡浸蜡1 h54℃石蜡包埋。

2) 组织切片:将包埋的组织按7 μm的厚度切片,在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加DEPC

处理水,组织片于42℃展片台上展片1小时,再置于40℃恒温箱中烘片12小时后放于4

密封保存备用。

3. 杂交前处理

切片经二甲苯脱蜡2×15 min,无水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min100%-95%-80%-50%-30%

乙醇脱水各5 min,后DEPC处理水2×5 min,然后进行杂交前切片处理,具体步骤如下:

1) lxPBS(pH7.4)室温孵育2x5 min

2) 0.3%TtitonX-100 PBS中去膜处理15 min

3) lxPBS洗涤2x5 min

4) RNase的蛋白酶K(20 g/mL)37℃消化30 min

5) 100mMGly/PBS中洗 2x5 min

6) lxPBS洗涤2x5 min

7) 4%多聚甲醛(4)固定 5min

8) lxPBS洗涤2x5 min

9) 含有 0.25%(W/v)的乙酸酐的 100mM 的三乙醇胺缓冲液(pH8.0)去电荷处理 15

min(现配现用)

10) lxPBS洗涤2x5 min

4.预杂交和杂交

1) 滴加预杂交液于载玻片上,然后置于湿盒中,50℃预杂交2小时。

2) 弃去预杂交液,立即滴加杂交液,置于湿盒中52℃杂交过夜。

5.杂交后处理

杂交完,以后的步骤不必要特意防RNA酶。

1) 弃去杂交液,载片浸入2xSSC2x15 min

2) 载片浸入1xSSC55℃水浴摇动2x15 min

3) 用含20g/mLRNaseANTE缓冲液37℃消化 30分钟,以去除未结合的探针。

4) 载片浸入0.5xSSC55℃水浴摇动2x15 min

5) 载片浸入0.5xSSC中室温10 min

6. 抗体反应

1) washing buffer清洗组织片5 min

2) 滴加封闭液缓冲液室温下处理组织片30 min

3) 用抗体液覆盖封闭后的组织片,置于湿盒中孵育3h以上。

4) Washing buffer 2x15 min

5) Detection buffer 中平衡2-5 min

7. 显色:加入显色液于湿盒中黑暗静止显色16h

8. 封片与观察:

1) 显色合适时,用TE buffer终止着色反应,再用蒸馏水清洗。

2) 滴加封片剂封片,显微镜下观察和摄影

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