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石蜡切片制作(苏木精-伊红对染法)

发布时间:2020-03-05浏览:1099次

                               

                                    石蜡切片制作(苏木精-伊红对染法)

实验原理:

石蜡切片是基本的切片技术,冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。

苏木素与伊红对比染色法(简称 H.E.对染法)是组织切片常用的染色方法。这种方法适

用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各种固

定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色,细胞核被苏木素染成蓝紫色,

细胞质被伊红染色呈粉红色。

一、器材及试剂:

1. 器材:

切片刀,切片机,恒温箱,蜡杯,酒精灯,解剖刀,解剖剪,解剖盘,培养皿,镊子,

单面刀片,毛笔,包埋盒,染色缸,盖玻片,载玻片,玻片盘,树胶,树胶瓶,显微镜,温

度计,脸盆,水浴锅。

切片机,切片刀,温台,恒温箱,解剖刀,镊子,剪刀,解剖针,单面刀片,小台木,洒精

灯,包埋纸盒,染色缸,烧杯,水盆,熔蜡炉,蜡杯。

2.试剂:

中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液, 1%

红酒精溶液,1%盐酸酒精溶液,甘油蛋白粘片剂,中性树胶。

卡诺(Carnoy)固定液,埃利希苏木精染液,1%伊红酒精溶液,1%盐酸乙醇液,各级酒

精(30%50%70%80%90%95%100%),二甲苯,甘油蛋白粘片剂,中性树

胶。

3. 材料:

鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、

茎、叶等。

二、实验原理:

石蜡切片是基本的切片技术,冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来

的。苏木素与伊红对比染色法(简称 H.E.对染法)是组织切片常用的染色方法。这种方

法适用范围广泛,对组织细胞的各种成分都可着色,便于全面观察组织构造,而且适用于各

种固定液固定的材料,染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色,细胞核被苏木素染成蓝

紫色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

三、试剂配法:

1.中性甲醛固定液:

       甲醛(37%-40%,市售,本所购买即为此浓度)  100mL

       磷酸氢二钠                                 6.5

       磷酸二氢钾(钠)                           4g       

双蒸水                                    900mL                                     

2.苏木精、伊红染色液为碧云天产品

31%盐酸乙醇液

盐酸 1

70%酒精 100

4.甘油蛋白贴片剂:

蛋白 50 ml

甘油 50 ml

水杨酸钠(防腐剂) 1g

配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中,去蛋黄留下蛋白,用玻棒调打成雪花状泡沫,然后

用粗纸或双层纱布过滤到量筒中,经数小时或一夜,即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加

等量的甘油,稍稍振摇使两者混合。后加入防腐剂(水杨酸钠)作防腐用。可保存几个月。

四、实验步骤:

1.取材

颈椎脱臼法处死小鼠,打开腹腔,剪取肝组织(或其他组织)。

切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以5mm×5mm×2mm10 mm×10

mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织,切成一小块23mm厚。

注意事项:

1)取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。

2.固定

将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下,立即投入中性福尔马林固定液中固定,固定

3050min

注意事项:

1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化

学变化,失去固定作用。

2)有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合

太早,固定时就没有作用了。

3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的 20~30 倍,有些水分多的材料,中

间应更换1-2次新液。

4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材

料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签

上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

3. 洗涤

材料经固定后,流水冲洗,数小时或过夜。

4. 脱水

材料依次经70%80%90%各级乙醇溶液脱水,各30min,再放入95%100%

2次,每次20min。各

注意事项:

1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。

2)在更换高一级的脱水剂时,不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水

剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。

3)在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。

4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。

5)如需过夜,应停留在70%酒精中。

6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象

5.透明

纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min(至透明为止)。

由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过

二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明

状态。

透明注意事项

1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。

2)更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿

气。

3)在透明过程中, 如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯

酒精中重新脱水,然后再透明。

6.透蜡

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。

透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗透到组织内部达到饱和程

度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在

55-60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h

透蜡注意事项

1)尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度;

2)透蜡温度要恒定,不可忽高忽低;

3)操作要迅速,力求在短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收

缩等。

7. 包埋

包埋时,用镊子夹取石蜡模子(金属质地)在酒精灯上稍加热,放在平的桌面上,从

温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热,夹取材料将切

面朝下放入蜡模中,排列整齐。再放上包埋盒,轻轻倒入熔蜡。

8. 切片

①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。

②将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。

③摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。

④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成15度左右。

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为4-10微米。

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带

提起,摇转速度不可太急,通常以40-50r/min

⑦切成的蜡带到20-30cm长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成

带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。

⑧用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否

良好。

⑨切片工作结束后,应将切片刀取下用氯 FANG擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。

9. 展片、贴片

打开水浴锅,使水温维持在40-45℃,另准备30%乙醇溶液。

切片时,将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。

用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在乙醇溶液的水面上,使切片展开。

③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开,用一个载玻片将切片完整,已展开的切片捞至温水

中,使之充分展开。

另取洁净的载玻片,捞起展开的切片,使其位于切片1/3处,另一端(磨边,粗糙的一

端)磨面上标记或贴上标签,放于切片架上。

10. 脱蜡复水

    将水浴锅温度调至60℃,待水温控制在60℃时,将切片连同切片架放入一干燥的染色

缸内,放入水浴锅中,盖上盖子(可密封),30min至蜡熔化。

之后,石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min,然后放入100%95%90%80%

 

 

 

70%各级酒精溶液中各3-5min,再放入蒸馏水中3min

11 染色

切片放入苏木精中染色约10-30min

染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,

染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

12.水洗

用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可),但要注意流水

不能过大,以防切片脱落。

13.分化

将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色,约2秒至数十秒钟。见切片变红,颜色较浅即可。

 

14.漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。

15.脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min

16、复染

0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min

伊红主要染细胞质,着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合,如果细胞核染色较

浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。

可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。

 

17.脱水Ⅱ

将切片放入 95%乙醇中洗去多余的红色,然后放入无水乙醇中 3-5min。后用吸水

纸吸干多余的乙醇。

18.透明

切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min

二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。

切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜

检。

19.封藏:中性树胶封存

因切片经二甲苯透明,使用中性树胶作为封藏剂,树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。

 

封藏的方法:

封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,在桌上放一张洁净的

吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的

中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的

右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避

免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在

干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

  

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