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一文看懂线粒体膜电位、线粒体质量、线粒体ROS检测染料及其优缺点

发布时间:2019-11-13浏览:1028次

 

原创: niwanmao 流式中文网 昨天

线粒体是细胞代谢的重要介质,是活性氧(ROS)的产生者和靶点,是ATP水平和钙稳态的调节剂,也是参与氨基酸、脂质和核苷酸合成的生物合成途径的枢纽。

线粒体存在于所有细胞中,它们的大小、形状和数量不同,这取决于细胞、基础组织和其他一些因素的代谢需求。考虑到它们在细胞和机体功能中的关键作用,在许多遗传和非遗传疾病以及癌症和衰老中观察到线粒体(mt)功能障碍并不奇怪。在绝大多数情况下,mt功能障碍的显著特征包括mt膜电位(mtmP)、mt质量和氧化还原电位的变化。

流式细胞仪可以快速监测完整细胞中的所有这些参数,避免mt分离和/或破膜造成的假象。现在已经有许多mt特异性荧光探针,可用于测量mtmPmt质量和mtROS,见下表:

线粒体膜电位检测原理和要点

mtmP是质子运动动力的主要组成部分,它是由mt基质泵到膜间空间的质子形成的。这种电位根据线粒体的状态而变化,与它们合成ATP的能力有关,是细胞健康的常见指标。mt基质是负电位的,因此用于测量mtmP的染料通常是亲脂性阳离子化合物,即带正电荷的分子,它们可以跨膜而不会与膜结合,并与mtmP成正比地积聚在mt基质中。超极化线粒体能积聚更多的染料,而去极化线粒体积聚的染料较少。

通过流式细胞术评估mtmP时,必须考虑两个要点:

首先,应仔细滴定染料浓度。高染料浓度会导致荧光猝灭,从而产生结果异常。虽然淬灭阈值因染料而异,但一般1–30 nM的浓度算足够低,大多能避免不必要的淬灭现象。

其次,必须使用功能性对照来确保染料信号的变化能得到正确解读,避免非特异性改变。合适的对照包括:

1.作为解偶联剂的FCCPCCCPvalinomycin,诱导去极化。2.oligomycin,一种ATP合成酶抑制剂,诱导去极化。3.nigericinK/H+离子载体,诱导超极化

不同线粒体膜电位染料优缺点

DiOC6已广泛用于流式细胞术研究中,但是,DiOC6作为NADH抑制剂的活性,以及对mt的毒性,强烈限制了该探针的使用。

DiOC6相似,罗丹明123Rh123)初用于不少研究,不过Rh123虽然容易进入细胞并迅速达到平衡,但不能很好地保留在里面。此外,在某些情况下,Rh123与线粒体的结合可能与线粒体能量状态无关,这进一步限制了其使用。

四甲基若丹明乙酯(TMRE)和四甲基若丹明甲酯(TMRM)也被广泛用于流式细胞术检测mtmP,这些染料无毒,染色后不易淬灭,但应以相对较低的浓度使用,可以在染色后立即进行分析,无需洗涤。这两种染料激发光均为488nm,发射波长574nm发射。通常,应准备未染色的样品(也称为空白样品),以设置背景荧光的水平。因此,通过TMRETMRM分析mtmP的变化时,就被定义为给定样品的MdFI的变化。

碳花青染料,尤其是JC-1被认为是检测mtmP的可靠探针。JC-1具有多色荧光发射光谱,并允许对mt去极化进行比例式半定量评估。在单体状态下,它发出绿色荧光(529 nm),而在高度依赖于mtmP的聚集状态下,它发出橙红色荧光(> 590 nm),在化合物诱导mtmP崩溃时,JC-1也会成为单体。这意味着,在健康细胞中,可以出现少量绿色,大多数为橙红色荧光,线粒体去极化的细胞大多仅显示绿色荧光。考虑到由于mtmP变化引起的荧光变化,显示结果的j方法是指示mtmP高或低的细胞百分比,而不是绿色和橙红色荧光之间的比率。

1993年以来,据报道,JC-1是几种细胞类型和测定条件的可靠膜电位指示剂,并且其与其他荧光探针的兼容性也已在多色方案中得到了证明。但是,JC-1对过氧化氢敏感、光敏感以及单体与聚集体形式之间的平衡速度较慢,可能会在一定程度上限制其使用。其它类似于JC-1的还有JC-9JC-10JC-9的单体或聚集体形式在522 nm激发,分别以535635 nm发射。JC-10490 nm激发,并在520 nm(单体形式)或590 nm(聚集形式)发射。

线粒体质量检测染料

线粒体质量可通过使用能够结合特定mt成分的染料进行监测,而与mt极化状态无关。因此,荧光量与mt含量成正比。Mito IDnonyl acridine orangeNAO)这两种染料能与mt内膜的cardiolipin结合,而MitoTracker染料与mt蛋白中存在的半胱氨酸残基的巯基反应。其中一些染料,包括MitoTracker deep red 633,也与mt蛋白形成共价键,因此在细胞染色后可以固定。与TMRETMRM类似的是,对于MitoTracker染料,应测量MdFI的变化。

线粒体ROS检测染料

关于mt ROS,近开发了两种荧光探针,分别是MitoSOXmi,以分别标记线粒体中的阴离子超氧化物和过氧化氢。

MitoSOX是氢乙啶化合物,可靶向定位到线粒体,依赖mtmP积累到线粒体中,氧化后与线粒体DNA结合后发出荧光。与其他探针类似,当使用MitoSOXmi时,必须准备足够的阳性和阴性对照全面验证生物系统中mt H2O2的存在。Antimycin A或阿霉素是MitoSOX染色的j阳性对照,而外源H2O2则是mi的正确阳性对照。MitoSOX染色的阴性对照是细胞可渗透的超氧化物歧化酶模拟物或mt解偶联剂,具体取决于细胞类型。对照的其它制备形式也可以用抗氧化剂来处理,例如N-乙酰半胱氨酸或其他能大大减少自由基产生的特异性清除剂。

目前已有不少文献通过流式细胞术对MitoSOXmi进行了测试,能选择性定量角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞和几种癌细胞系中的mt阴离子超氧化物和mt过氧化氢,也有报道可能在同一细胞中同时使用MitoSOXmi来分析活细胞中的mt ROS

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