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小鼠胚胎成纤维细胞

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详细介绍

小鼠胚胎成纤维细胞

一、实验材料准备

1.   动物
 

孕期14至16天的孕鼠(小鼠)。
 

2.   试剂

无Ca2+和Mg2+的PBS(D-PBS)、0.05%胰酶、0.53 mmol/L EDTA溶液、MEF生长培养基(高糖DMEM加10%FBS)。
 

3.  器械
 

眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50 ml和15 ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。


二、具体操作


1.  处死孕鼠,全身置于75%酒精里浸泡,然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开,用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层,露出子宫,最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中,冲洗去血。

 

2.  用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除,然后夹掉头和内脏,将其余胚胎转移到一个装有30 ml D-PBS的50 ml离心管中,轻轻颠倒两次,倒掉D-PBS,再重复此步骤一次,注意要留少许D-PBS,然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中,并用手术刀片将其细细切碎。

 

3.  用200 ul的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体,转移至15 ml离心管中,于4℃ 1500 rpm离心5分钟,倒掉上清,以10 ml胰酶重悬沉淀,放在37℃水浴中消化30分钟,且每隔五分钟轻轻晃动,使之充分消化。

 

4.   将上层细胞悬液倒入一个装有10 ml MEF生长培养基的50 ml离心管中,用200目的尼龙网过滤后,以1 500 rpm离心5分钟收集细胞,再用30 ml MEF生长培养基洗涤两次。

 

5.  细胞沉淀用15 ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数(一般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。

 

6.   3x106细胞悬浮于15 ml MEF生长培养基中,接种到200 ml培养瓶中。

 

7.  24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

 

8.  细胞长满后,先用D-PBS冲洗,倒掉后加胰酶消化(此步时间不宜过长,作者一般不超过五分钟),按1:5传代。

 

9.  细胞再次长到覆盖率80-90%左右,将其消化后,常规冻存(冻存液要现配)。小鼠胚胎成纤维细胞

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