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流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI法)

发布时间:2019-12-10浏览:1381次

流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI)

Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI 

摘要:磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserinePS) 又称复合神经酸,位于正常细胞膜的胞质一侧,在细胞凋亡早期,PS可从细胞膜胞质侧翻转到细胞膜外表面。基于此现象,利用Ca2 +依赖性Annexin V可与PS特异性结合,且亲和力高,适用于细胞凋亡早中期的检测。PI为一种核酸染色剂,与细胞核结合将细胞核染为红色。PI不可透过正常的细胞膜,可透过凋亡中晚期以及坏死细胞的细胞膜,适用于在排除细胞坏死的前提下细胞凋亡中晚期检测。将Annexin VPI同时使用,通过分群表征出正常、坏死、凋亡和机械性损伤的细胞。在该实验中,我们对HeLa细胞的对照组和H2O2诱导组进行Annexin V/PI双标记,经流式细胞仪检测出不同特性的细胞群。

关键词: 细胞凋亡, Annexin V/PI, 流式检测, HeLa细胞

材料与试剂

1.      5 ml流式管 (Falconcatalog number: 352008)

2.      15 ml离心管 (Falconcatalog number: 352097)

3.      HeLa细胞

4.      Annexin V-Alexa Fluor™488 (Invitrogencatalog number: A13201)

5.      PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrichcatalog number: P4170)

6.      NaCl 

7.      Na2HPO4 

8.      KCl 

9.      KH2PO4

10.  H2O2

  1. DEME培养基
  2. HEPES
  3. CaCl2
  4. PI染色工作液 (见溶液配方)
  5. 1× Binding buffer (见溶液配方)
  6. PBS (见溶液配方)
  7. 800 μM H2O2 (见溶液配方)

仪器设备

1.      水平离心机 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)

2.      光学显微镜 (Olympus, model: IX73)

3.      流式细胞仪 (FACSFortessa)

实验步骤

1.      染色前处理

1.1

将收集到的细胞,用预冷1× PBS (4 °C) 重悬一次,300 × g , 离心5分钟,弃上清,收集细胞。

1.2

加入300 μl1× Binding Buffer重悬细胞,调整细胞浓度至1 × 106/ml

2.      Annexin V/PI染色

  1. 取流式管,按顺序编好空白管,单阳管和样本管号。流式管中分别加入经200目细胞过滤膜过滤好的100 μl细胞悬液,单阳管中分别加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™48810μl PI碘化丙啶轻轻混匀。
  2. 2.2
  3. 样本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488轻轻混匀;再加入10 μl PI碘化丙啶轻轻混匀。
  4. 2.3
  5. 室温避光孵育10~20分钟,加入400 μl 1× Binding Buffer,随后置于冰浴中,上机检测,所选通道如下:
    Alexa Fluor™488488 nm激发,采集波段530/30
    PI561 nm激发,采集波段610/20
  6.  
  7.                 图1. 前向 (FSC) 和侧向 (SSC) 圈出HeLa细胞

      

               图2. Annexin V/PI双标记HeLa细胞凋亡检测

9.     
如图1所示通过前向 (FSC) 和侧向 (SSC),分别圈出的对照组和H2O2诱导组的HeLa细胞范围有所差别。诱导凋亡组的细胞已呈现出分群的趋势。图2Annexin V/PI双标记的结果,如图2A所示对照组的HeLa细胞处于正常状态,但也有少许凋亡晚期的细胞,原因是培养的HeLa细胞浓度过高,导致培养基里的营养消耗过快,少许细胞因饥饿发生凋亡。图2B中显示,经H2O2诱导HeLa细胞出现了显著的早期凋亡现象,比例由1.06%增至7.43%;凋亡晚期的细胞比例呈明显增长趋势。综上可知,双标记方法可以准确地反映凋亡过程:Annexin V标记的单阳性细胞为凋亡早期细胞;Annexin V PI双标记的双阳性细胞为凋亡晚期细胞 (Koç,等,2018)PI标记的单阳性细胞为坏死细胞;两者均未标记上的双阴性细胞为活细胞。由此将凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、坏死细胞与正常细胞区别开。因此,可作为检测细胞凋亡的好方法 (Schutte等,1998)

注意事项

1.      使用前低速离心,以免液体积存管盖和管壁。

2.      如果用含EDTA的胰酶消化时,注意必须彻底清除EDTA:在标记前用1× PBS 1× Binding buffer洗涤,清除EDTA,以免残余的EDTACa2+螯合,影响Annexin V的结合。

3.      Annexin V-Alexa Fluor™488PI是光敏物质,在操作时请注意避光。在处理和标记时,尽可能在暗处进行。在孵育阶段,用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后,在暗室内用显微镜观察。

4.      整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在4 °C下操作,以免影响细胞状态。

5.      在细胞洗涤后,请尽量将上清弃净,以免PBS残留,有可能会影响实验结果。

6.      为防止荧光衰变,宜在1小时内进行流式检测。

7.      PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,建议首先进行Annexin V-Alexa Fluor™488染色,可在上机前5分钟再加入PI染色。

溶液配方

1.      PBS
NaCl 8 g
Na
2HPO4 2.9 g
KCl 0.2 g
KH
2PO4 0.2 g
溶于1L ddH2O中,调pH值为7.2~7.4
过滤灭菌
4 °C保存

2.      800 μM H2O2 
30% H2O2 2 μl溶于880 μl 1× PBS中,配成20 mM的母液
再取80 μl母液溶于2 ml DEME培养基

3.      PI染色工作液
1 mg/mL PI原液+无菌PBS1:10稀释成100 μg/ml工作液
4 °C保存待用

4.      1× Binding buffer
10 mM HEPES
140 mM NaCl
2.4 mM CaCl
2
pH 7.4

参考文献

1.      Koç, E. , Çelik-Uzuner, S., Uzuner, U. and Çakmak, R. (2018). The Detailed Comparison of Cell Death Detected by Annexin V-PI Counterstain Using Fluorescence Microscope, Flow Cytometry and Automated Cell Counter in Mammalian and Microalgae Cells. J Fluoresc 28(6): 1393-1404.

2.      Schutte, B., Nuydens, R., Geerts, H. and Ramaekers, F. (1998). Annexin V binding assay as a tool to measure apoptosis in differentiated neuronal cells. J Neurosci Meth 86(1): 63-69.

  1. Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
  2. 引用格式:葛灵, 王雪冬, 丁宇波, 边玮. (2019). 流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI). Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.
    How to cite: Ge, L., Wang, X. D., Ding Y. B. and Bian, W. (2019). Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI.Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.

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