流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI法)

Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI 

摘要：磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine，PS) 又称复合神经酸，位于正常细胞膜的胞质一侧，在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜胞质侧翻转到细胞膜外表面。基于此现象，利用Ca^{2 +}依赖性Annexin V可与PS特异性结合，且亲和力高，适用于细胞凋亡早中期的检测。PI为一种核酸染色剂，与细胞核结合将细胞核染为红色。PI不可透过正常的细胞膜，可透过凋亡中晚期以及坏死细胞的细胞膜，适用于在排除细胞坏死的前提下细胞凋亡中晚期检测。将Annexin V与PI同时使用，通过分群表征出正常、坏死、凋亡和机械性损伤的细胞。在该实验中，我们对HeLa细胞的对照组和H₂O₂诱导组进行Annexin V/PI双标记，经流式细胞仪检测出不同特性的细胞群。

关键词: 细胞凋亡, Annexin V/PI, 流式检测, HeLa细胞

材料与试剂

1.      5 ml流式管 (Falcon，catalog number: 352008)

2.      15 ml离心管 (Falcon，catalog number: 352097)

3.      HeLa细胞

4.      Annexin V-Alexa Fluor™488 (Invitrogen，catalog number: A13201)

5.      PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrich，catalog number: P4170)

6.      NaCl 

7.      Na₂HPO₄ 

8.      KCl 

9.      KH₂PO₄

10.  H₂O₂

1. DEME培养基
2. HEPES
3. CaCl₂
4. PI染色工作液 (见溶液配方)
5. 1× Binding buffer (见溶液配方)
6. PBS (见溶液配方)
7. 800 μM H₂O₂ (见溶液配方)

仪器设备

1.      水平离心机 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)

2.      光学显微镜 (Olympus, model: IX73)

3.      流式细胞仪 (FACSFortessa)

实验步骤

1.      染色前处理

1.1

将收集到的细胞，用预冷1× PBS (4 °C) 重悬一次，300 × g , 离心5分钟，弃上清，收集细胞。

1.2

加入300 μl的1× Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度至1 × 10⁶/ml。

2.      Annexin V/PI染色

1. 取流式管，按顺序编好空白管，单阳管和样本管号。流式管中分别加入经200目细胞过滤膜过滤好的100 μl细胞悬液，单阳管中分别加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488或10μl PI碘化丙啶轻轻混匀。
2. 2.2
3. 样本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488轻轻混匀；再加入10 μl PI碘化丙啶轻轻混匀。
4. 2.3
5. 室温避光孵育10~20分钟，加入400 μl 1× Binding Buffer，随后置于冰浴中，上机检测，所选通道如下：
   Alexa Fluor™488：488 nm激发，采集波段530/30；
   PI：561 nm激发，采集波段610/20。
6. 
7.  
8.                 图1. 前向 (FSC) 和侧向 (SSC) 圈出HeLa细胞

               图2. Annexin V/PI双标记HeLa细胞凋亡检测

9.     
如图1所示通过前向 (FSC) 和侧向 (SSC)，分别圈出的对照组和H₂O₂诱导组的HeLa细胞范围有所差别。诱导凋亡组的细胞已呈现出分群的趋势。图2为Annexin V/PI双标记的结果，如图2A所示对照组的HeLa细胞处于正常状态，但也有少许凋亡晚期的细胞，原因是培养的HeLa细胞浓度过高，导致培养基里的营养消耗过快，少许细胞因饥饿发生凋亡。图2B中显示，经H₂O₂诱导HeLa细胞出现了显著的早期凋亡现象，比例由1.06%增至7.43%；凋亡晚期的细胞比例呈明显增长趋势。综上可知，双标记方法可以准确地反映凋亡过程：Annexin V标记的单阳性细胞为凋亡早期细胞；Annexin V 与PI双标记的双阳性细胞为凋亡晚期细胞 (Koç,等，2018)；PI标记的单阳性细胞为坏死细胞；两者均未标记上的双阴性细胞为活细胞。由此将凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、坏死细胞与正常细胞区别开。因此，可作为检测细胞凋亡的好方法 (Schutte等，1998) 。

注意事项

1.      使用前低速离心，以免液体积存管盖和管壁。

2.      如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须*清除EDTA：在标记前用1× PBS或 1× Binding buffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2+螯合，影响Annexin V的结合。

3.      Annexin V-Alexa Fluor™488和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察。

4.      整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4 °C下操作，以免影响细胞状态。

5.      在细胞洗涤后，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。

6.      为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。

7.      PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-Alexa Fluor™488染色，可在上机前5分钟再加入PI染色。

溶液配方

1.      PBS
NaCl 8 g
Na₂HPO₄ 2.9 g
KCl 0.2 g
KH₂PO₄ 0.2 g
溶于1L ddH₂O中，调pH值为7.2~7.4
过滤灭菌
4 °C保存

2.      800 μM H₂O₂ 
取30% H₂O₂ 2 μl溶于880 μl 1× PBS中，配成20 mM的母液
再取80 μl母液溶于2 ml DEME培养基

3.      PI染色工作液
1 mg/mL PI原液+无菌PBS按1:10稀释成100 μg/ml工作液
4 °C保存待用

4.      1× Binding buffer
10 mM HEPES
140 mM NaCl
2.4 mM CaCl₂
pH 7.4

参考文献

1.      Koç, E. , Çelik-Uzuner, S., Uzuner, U. and Çakmak, R. (2018). The Detailed Comparison of Cell Death Detected by Annexin V-PI Counterstain Using Fluorescence Microscope, Flow Cytometry and Automated Cell Counter in Mammalian and Microalgae Cells. J Fluoresc 28(6): 1393-1404.

2.      Schutte, B., Nuydens, R., Geerts, H. and Ramaekers, F. (1998). Annexin V binding assay as a tool to measure apoptosis in differentiated neuronal cells. J Neurosci Meth 86(1): 63-69.

1. Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
2. 引用格式：葛灵, 王雪冬, 丁宇波, 边玮. (2019). 流式细胞术检测细胞凋亡 (Annexin V/PI法). Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.
   How to cite: Ge, L., Wang, X. D., Ding Y. B. and Bian, W. (2019). Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI.Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.